鞘内注射右美托咪定对神经病理性疼痛大鼠DRG神经元GABAA受体激活电流的影响*

樊 超 王 洋 杨 晴 许晓东 杨晓宇 司军强 安慧霞 高松宝

（1郑州市骨科医院麻醉科，郑州450052；2石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002；3河南大学淮河医院麻醉科，开封475000；4河南省人民医院麻醉科，郑州450003；5郑州大学第三附属医院妇产科，郑州450052）

神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)属于一种慢性疼痛，由躯体感觉神经系统的损伤或病变而直接造成，常表现出自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛等临床特征。发病率较高，发生机制较为复杂、治疗周期长、效果差。因此，神经病理性疼痛已经成为全球范围内神经科学研究的一个重要难题。目前临床上主要应用阿片类药物来缓解疼痛，但其并不能完全逆转或终止NP的发作。动物研究[1]发现右美托咪定联合阿片类药物鞘内给药可有效缓解疼痛，并能够减少阿片类药物的用量，降低不良反应的发生。临床研究[2]也证实局部注射右美托咪定可以有效缓解疼痛的发生和减少阿片类药物的应用，提高镇痛的质量。另外，右美托咪定联合局麻药物鞘内给药不仅能够延长局麻药物作用时间，而且可以降低不良反应的发生率[3]。因此，右美托咪定在镇痛领域具有广阔的应用前景。

右美托咪定作为一种高度选择性的α2肾上腺能受体激动剂，α2肾上腺能受体激动后通过不同信号通路产生镇静、镇痛、抑制交感神经活动等不同效应[4]。脊髓是右美托咪定产生镇痛作用的主要部位，但其在脊髓水平产生镇痛的机制尚不完全明确。研究表明突触前抑制参与了疼痛的调节作用[5]，γ-氨基丁酸(GABA)是脊髓中主要的抑制性神经递质，在脊髓背角，GABAA受体通过突触前抑制作用，减少初级传入神经末梢兴奋性神经递质的释放，即“突触前抑制”来参与神经病理性痛的发生[6]。而背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)细胞膜上存在大量GABAA受体，在缓解疼痛的作用中起着关键作用[7,8]。那么，右美托咪定是否通过参与神经病理性疼痛大鼠DRG神经元上GABAA受体功能的调节产生镇痛作用，尚未可知。因此，本研究通过建立大鼠坐骨神经压迫性损伤模型(chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI)，经鞘内注射右美托咪定，通过测试热缩足潜伏期变化，应用全细胞膜片钳技术记录右美托咪定对CCI模型大鼠DRG神经元GABAA受体介导的膜电流的影响，进一步探讨鞘内注射右美托咪定对神经病理性疼痛的作用及其机制。

方 法

1.主要材料和仪器

实验所用动物由新疆医科大学实验动物中心提供且通过动物伦理学审批的6周龄SD大鼠(180～220 g)，雄性大鼠，动物质量符合一级标准。葡萄糖酸钾、胶原酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂、荷包牡丹碱(bicuculline)、GABA、HEPES为Sigma公司产品，右美托咪定注射液（200 μg: 2 ml，江苏恒瑞医药股份有限公司）。其余试剂均为国产分析纯试剂。Axon 700B放大器（美国MD公司）、P-97拉制仪（美国Sutter公司）、生物电信号记录计算机（Axoscope 10.2 软件，美国MD公司）。

2.大鼠鞘内置管方法

雄性SD大鼠，体重180～220 g，鞘内置管参照文献[9]并加以改进，大鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠(35～38 mg/kg)麻醉后，以髂棘(L6)为中点，沿背部正中间纵向切开皮肤（约1.5 cm），测量进针处（L5-L6间隙，平髂棘，与末肋的距离约为3～3.5 cm），沿L5-L6棘突正中间垂直插入导针，进入蛛网膜下腔时有明显的突破感，然后将导针头端向大鼠头端倾斜，自导针置入Microspinal导管3～3.5 cm即可到达腰膨大部分，此过程中可见后肢抽动。拔出导针，在皮下从切口处向头端造一隧道，将导管沿隧道放入皮下，前端从颈后方穿出，通过缝合线固定于皮肤，其前端保留4 cm。热熔封闭管的外端口，以防脑脊液外溢。给药时，剪去熔封的末端，30 µl的微量进样器针头直接插入Microspinal导管内给药。给药速度均匀且缓慢，约15 s，给药后再熔封管口。大鼠清醒后24 h观察其活动情况，剔除出现运动功能障碍的大鼠。大鼠鞘内注射2%利多卡因20 µl，出现双后肢麻痹现象认为导管位置正确，剔除注药30 min内未出现双后肢麻痹大鼠。观察5天，对未出现运动障碍和体重明显下降的大鼠进行实验分组及建模。

3.CCI模型制备

鞘内置管成功的雄性SD大鼠36只体重180～220 g。随机12只作为CCI组、12只制备S组、12只作为D组。CCI模型制备参照文献[10]，大鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠(35～38 mg/kg)麻醉，备皮后严格遵循无菌原则进行手术。在股骨外侧纵向切开皮肤，钝性分离肌肉，充分暴露坐骨神经，在坐骨神经三叉分支的近端约5 mm 处，采用铬肠线做4道结扎间距为1 mm，结扎的松紧度以不影响神经外膜的血运为宜，然后逐层缝合。S组除不做铬肠线结扎外其余方法同上。D组结扎坐骨神经后即刻至牺牲每天鞘内注射右美托咪定2 µg/kg，生理盐水稀释至10 µl，1次/日，持续14天。S组和CCI组以等量生理盐水替代。各组均加强营养并且单独饲养，严格12 h明暗交替光照。

4.热缩足潜伏期实验

术前1 d记为T0，术后3、5、7、10、14 d分别 记 为 T1、T2、T3、T4、T5。 分 别 在 T0、T1、T2、T3、T4、T5给药30 min后，对CCI组、S 组和D组大鼠进行TWL测试，采用热刺痛仪DB020（北京智鼠多宝生物科技有限责任公司），将大鼠置于3 mm厚的玻璃板上，热辐射照射到术侧下肢足底中部，记录从光源照射到出现缩足反应的时间，即为热痛阈，每只测试3次，每次间隔8 min，取其平均值，每次测试时间为上午9～11点。

5.全细胞膜片钳记录

参考文献[11]将S组、D组和CCI组（术后14 d）大鼠击昏、断头后迅速切开背部皮肤沿脊柱两侧剪断与之相连的肋骨, 取出手术侧L4-L6段DRG置于O2饱和的细胞外液中，外液成分(mmol/L)：NaCl 150；KCl 5；CaCl22.5；MgCl21；HEPES 10；D-glucose 10，Ph = 7.4 溶液渗透压为330 mOsm。在显微镜下用角膜剪及游丝镊剪除相连的神经和结缔组织，将分离出的DRG剪碎转移至培养皿内，加胰蛋白酶0.25 mg/ml，胶原酶0.5 mg/ml后移于试管中，在37 ℃恒温箱中孵育15 min。然后加入适量胰蛋白酶抑制剂 (soya bean trypsin inhibitor, typeⅡ2s) 终止胰蛋白酶的消化。将上述机械分离和酶处理的DRG神经元离心(800 r/min, 6 min)，然后转移至培养皿内，室温(22～30 ℃)下静置40 min。

选择贴壁良好、轮廓及形态清晰、胞膜完整有光晕折光性强且胞质均匀的中小神经元。使用Axon700B放大器（美国MD公司）进行实验记录，玻璃微电极用P-97拉制仪（美国Sutter公司）拉制，电极阻抗约为1～5 MΩ，玻璃微电极所充内液成分为 (mmol/L)：KCl 140；CaCl21；MgCl22；HEPES 10；EGTA 11，在电极与细胞膜形成高阻(1～5 GΩ)封接后将膜吸破，然后调节电容和串联电阻补偿保持电压为负60 mV。膜电流应用低通滤波(10 Hz)[11]。GABA采用无糖外液配制成0.1、1.0、10.0、100.0、1000.0 µmol/L。参考文献[12]给药系通过微操纵器移动快速换液装置的排药管进行，排药管的每个管口的直径0.5 mm, 在全细胞模式记录下，开放装有GABA的排药管，快速移至所检测细胞同一平面，管口距所记录的细胞约100 µm，在倒置显微镜下可见灌流的药液完全覆盖检测细胞。GABA灌流5 s后移开加药管口并关闭，记录GABAA受体激活电流，将处于开放状态的细胞外液管口移至检测细胞洗脱5 min，然后灌流另一浓度的GABA，依次由低浓度到高浓度灌注。灌流GABA100 µmol/L 5 s，记录到IGABA，洗脱5 min后，预灌流GABAA受体选择性拮抗剂荷包牡丹碱100 µmol/L 30 s时，灌流GABA100 µmol/L 5 s，未记录到IGABA。则记录到的GABA电流为GABAA受体激活电流。实验在室温22～30℃范围进行。

6.统计学方法

所有计量数据表示为均数±标准差(±SD)，采用 SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，多组比较采用单因素方差分析，成组数据比较采用独立样本t检验，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

CCI组手术侧下肢术后发生明显行为学改变，不能负重，行走时跛行，下肢可出现踮脚、频繁舔后足、回缩等现象（见图1），与T0比较，CCI组和 D 组 T1、T2、T3、T4、T5时 TWL 缩短 (P＜ 0.05)；与 S组 比 较，CCI组 和 D 组 T1、T2、T3、T4、T5时TWL明显缩短(P＜ 0.05)；与D组比较，CCI 组T1、T2、T3、T4、T5时 TWL 缩短 (P＜ 0.05)；三组DRG神经细胞见图2，在全细胞膜片钳实验中选择细胞直径15～40 μm，受测的119个细胞中有102个对外加GABA 85.7% (102/119)敏感，其中34个细胞是CCI组、32个细胞是S组、其中36个细胞是D组，且不同浓度的GABA (0.1～1 000 µmol/L)激活为浓度依赖性的内向电流。此反应可被GABAA受体选择性拮抗剂bicuculline (100 µmol/L)所阻断（见图3），提示GABA 激活的电流由GABAA受体所介导。

图1 三组大鼠不同时间点热缩足反射潜伏期随时间变化(n = 12,±SD)Fig.1 The incubation latency of three groups of rats at different time points is different with time (n = 12,±SD)

图2 三组DRG神经细胞Fig.2 Three groups of DRG nerve cells

图3 GABA-AR特异性拮抗剂bicuculline (100 µmol/L)对GABA激活膜电流的阻断作用 (±SD)**P ＜ 0.01，与GABA激活电流比较Fig.3 GABA-AR specific antagonist bicuculline (100 mol/L)blocked GABA activated membrane current (±SD)**P ＜ 0.01, compared with GABA activated membrane current.

在CCI 组、S组、D组的DRG神经元上GABA (0.1～1 000 µmol/L)引起的内向电流具有浓度依赖性（见图4），相同浓度的GABA在CCI 组激活的电流幅度均小于S组和D组(P＜ 0.05)，相同浓度的GABA在D组激活的电流幅度均小于S组(P＜ 0.05)。GABA (100 µmol/L)在 CCI组、D组和S组激活电流幅值分别为(452±78)、(827±173)、(1267±215) pA (n= 8～11)。

讨 论

图4 S组、D组、CCI术侧组DRG神经元GABA激活电流呈浓度依赖性(n = 8-11,±SD)(A)：示例图；(B)：电流量效曲线注#P ＜ 0.05、*P ＜ 0.05、##P ＜ 0.001、**P ＜ 0.001，与S 组比较，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.001，与 CCI组比较Fig.4 GABA activation currents of DRG neurons in Sgroup, D group and CCI side group were dose-dependently.current dose effect curves (n = 8-11,±SD)#P ＜ 0.05、*P ＜ 0.05、##P ＜ 0.001、 **P ＜ 0.001,compared with S group; #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.001, compared with CCI group.

本研究参考文献[13]选择右美托咪定的实验剂量。实验中发现CCI组和D组在术后3、5、7、10、14 d时热缩足反射潜伏期(Thermal withdrawal latency, TWL)降低，痛觉过敏，提示大鼠CCI模型制备成功。研究结果显示，与S组比较，D组和CCI组在术后TWL缩短，与D组比较，CCI组术后TWL缩短，D组DRG神经元上GABAA受体介导的膜电流大于CCI组。提示右美托咪定直接或间接增强了GABAA受体的功能，缓解了大鼠神经病理性疼痛的发生，提示神经病理性疼痛大鼠产生了痛觉的高敏性，而右美托咪定对疼痛起到一定的缓解作用。

本实验中选择了DRG神经元进行全细胞膜片钳研究，因为DRG神经元是躯体感觉的初级传入神经元，在疼痛的发生和维持中发挥至关重要的作用。它不仅是感觉冲动由外周向中枢传导的通路，而且对传入终末部位的初级感觉信息通过突触前抑制作用进行调控。研究表明[14]DRG神经元上主要的突触前抑制性神经递质是GABA，而GABA发挥突触前抑制作用的主要功能是由GABAA受体所介导。本实验中灌流GABA激活的内向膜电流，可被GABAA受体选择性拮抗剂bicuculline所阻断，提示GABA激活的膜电流由GABAA受体所介导。GABAA受体属于配体门控离子通道受体，由GABA识别位点、苯二氮卓受体识别位点、氯离子通道三部分组成，当GABA与其受体结合，引起与之相偶联的Cl-通道开放，引起大量Cl-外流，产生突触前抑制，使后传入的感觉信息引起神经末梢的动作电位减小，从而减少兴奋性神经递质在神经末梢的释放，致使脊髓背角二级感觉痛敏神经元活动减少，产生镇痛作用[15]。

本研究电生理结果表明，CCI组DRG神经元上GABAA受体介导的膜电流小于S组(P＜ 0.05)，这一结果与本实验室前期研究一致[16]。提示神经病理性疼痛的损伤导致了相应的DRG神经元上GABAA受体功能减弱，其机制可能是，在神经病理性疼痛发生发展过程中导致突触前膜GABAA受体表达的下调，或者是突触前膜GABAA受体发生了磷酸化或脱磷酸化，使受体的功能活动降低[17]。GABAA受体功能的改变是介导神经病理性疼痛的重要因素之一。Naik等[18]研究发现在神经病理性疼痛大鼠损伤DRG神经元周围给予GABAA受体的激动剂muscinol和gaboxadol，能产生浓度依赖性地缓解神经病理性疼痛症状，而GABAA受体的拮抗剂bicuculline却能加重神经病理性痛的症状，提示GABAA受体参与了神经病理性疼痛的传递和调节作用，与本研究结果相一致。

右美托咪定属α2肾上腺能受体激动剂，α2受体是G蛋白偶联受体，G蛋白偶联受体介导一系列重要的生理应答及药理学效应。激动后通过不同信号传导通路产生不同效应。蓝斑是右美托咪定主要镇静位点，脊髓是右美托咪定主要镇痛部位，从而产生镇静、镇痛作用，抑制交感神经活动等效应。右美托咪定抑制腺苷酸环化酶活性和环磷腺苷合成，抑制钙通道，激活超极化钾通道，抑制钙内流至神经末梢，抑制递质释放[19]。本实验结果表明：右美托咪定增强了GABAA受体的功能，我们推测可能是右美托咪定激动了G蛋白偶联受体，介导了不同信号传导通路的效应，激活了GABAA配体门控离子通道受体，降低Cl-通道开放的阈值，引起大量Cl-外流，产生突触前抑制作用，可能是其产生脊髓水平的镇痛机制之一。关于右美托咪定是如何在脊髓水平增强GABAA受体功能的机制，有待进一步探讨研究。

综上所述，右美托咪定可通过增强DRG神经元上GABAA受体介导的膜电流，从而增强GABA介导的突触前抑制作用，减轻大鼠神经病理性疼痛。