免疫因子的表达与原发免疫性血小板减少症的关系

包萃华 乌兰 杨海平 白图克 戴玉 赵敬泽 韩泽 刘大海 王琦

免疫性血小板减少性紫癜（Immune Thrombocytopenic Purpura，ITP）是一种是常见的出血性疾病，其发病过程较为复杂，目前尚无统一说法。以往认为是自身免疫介导的血小板被破坏而造成的；但临床实践证实，仅60%患者为上述机制造成的，这一结果证实仍存在着其他机制。近年来，有学者认为[1]：调节性T细胞（Treg）可能也参与了ITP的发生发展。辅助性T细胞17（Th17）是一种新型CD4+T细胞亚群，可特异性产生白细胞介素（IL-17），通过诱导中性粒细胞增殖、成熟、趋化，产生促炎性因子，在细胞外感染防御、介导慢性炎症及自身免疫性疾病发挥作用。正常情况下，Treg细胞与Th17细胞某种程度下可相互转化，维持动态平衡。一旦平衡不能维持，就发生疾病。CD4+CD25+CD127-/low Treg细胞是Treg的代表细胞，可能与ITP的发病有关。因此，本文就CD4+CD25+CD127-Treg细胞及Th17细胞IL-23与其受体CCL-20形成的轴与ITP发病间的关系进一步研究。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取本院及内蒙古医科大学第三附属医院就诊的成人ITP患者45例作为ITP组，其中男性9例，女性36例，年龄28～76岁，平均年龄为（50.8±2.2）岁。选取同期健康成人45例作为对照组，其中男性17例，女性28例，年龄25～72岁，平均年龄为（50.2±2.3）岁。两组患者的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），可对比。

纳入与排除标准：符合《血液病诊断及疗效标准》（张之南编第三版）[2]。

1.2 实验材料

流式细胞仪（贝克曼库尔特），低速离心机（TD4），涡旋振荡器（XK96-A），移液器（20 μL、100 μL、1 000 μL），抗凝采血管（EDTA抗凝或肝素抗凝），流式上样管，CD3（货号：555332），CD8（货号：555388），CD4-FITC（货号：340133），CD25-APC（货号：662525），CD127-PE（货号：351304），IL-17A（货号：560436）（购自美国BD公司），溶血素BD FACS Lysing Solution（货号：349202），去离子水。

1.3 实验方法

1.3.1 样本采取全血 使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，8 h内分析完成。

1.3.2 检测方法 以FC500流式细胞仪检测外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞；贝克曼FC 500流式细胞仪检测Th 17细胞；ELISA法检测血浆中细胞因子IL-23，CCL-20因子。按照试剂盒中推荐的步骤进行操作。

1.4 统计学方法

所有数据均采用统计学软件SPSS 21.0进行分析处理，计量资料以（）描述，正态分布采用t检验，偏态分布采用秩和检验；计数资料以（%）表示，采用χ2检验；以α＝0.05为检验标准，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

ITP组外周血CD4细胞中Th17细胞的比例为（0.84±0.04）%，高于对照组的（0.50±0.02）%，差异有统计学意义（t＝51.000，P＝0.000）。

外周血CD8L-1细胞中，CD8L-1+T细胞、Th17、CD4+CD25+CD127-Treg的比例比较，ITP组分别为：（28.05±4.2）%、（0.84±0.04）%、（1.23±0.38）%，对照组分别为：（47.80±3.10）%、（0.50±0.02）%、（2.90±0.62）%，ITP组CD8L-1+T细胞、CD4+CD25+CD127-比例低于对照组，差异有统计学意义（t=25.380、51.000、15.406，P=0.000、0.000、0.000）。

血浆中，IL-23、CCL-20细胞因子水平比较，ITP组分别为：（62.01±11.08）pg/mL、（7.92±3.80）pg/mL，对照组分别为：（32.01±3.54）pg/mL、（3.27±1.32）pg/mL，ITP组高于对照组（t＝17.301、9.309，P＝0.000、0.000）。

3 讨论

ITP的发病机制较为复杂，且目前尚无统一标准，以往较为公认的是由血小板自身抗体导致，但随着人们ITP的深入研究，很多人们更加倾向于细胞免疫异常。

Treg细胞是一类T细胞亚群，主要用于控制体内自身免疫反应，维持免疫平衡，一旦表达异常时，可导致自身免疫性疾病的发生[3-5]。Treg细胞可通过抑制其他免疫细胞，发挥免疫抑制或无能作用[6-7]。Treg细胞活化后，通过细胞接触依赖或分泌抑制性因子，发生主动免疫抑制。近年来，研究发现：多种自身免疫性疾病中存在Treg数量和功能异常现象[8-10]。Treg细胞除了表达CD4和CD25外，还特异性表达CD127-，CD4+CD25+CD127-Treg细胞，能够抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖，可控制自体活化的T细胞[11]。如CD4+CD25+CD127-Treg细胞减少，则细胞免疫抑制作用减弱，平衡遭到破坏，机体免疫功能紊乱。黄文烨[12]的研究中，证实：CD4+CD25+CD127-Treg及TGF-β在初发ITP患者中表达低于正常人群，这一观点与本次研究结果“ITP患者外周血中Treg细胞数减少”相一致，表明Th17细胞在ITP中的高表达，证实Th17细胞在ITP的发生、发展过程中具有重要的作用，这也证实Th17细胞介导的自身免疫性损伤在ITP的发生发展中有着重要的作用。虽然能够证实Treg细胞、Th17细胞参与了ITP的发生发展，但并不能完全确定，仍需要大量的研究进行验证。

IL-23是L-12家族的新成员，可与细胞表面IL-23R结合，能够调节自身免疫功能；还可促进CD4T细胞产生炎性细胞因子IL-17，调节性T细胞（Greg cell）减少，进而参与自免疫性疾病的发展。ccL20也被称为肝活化调节趋化因子，巨噬细胞炎症蛋白-3α（MIP-3α）和exodus-1，它在炎症相关细胞如N（中粒）NK细胞、Th17细胞、B 细胞及其他多种免疫细胞中表达其受体CCR6能调节炎症和调节性T细胞的迁移，CCR6缺乏的Th17细胞其本身及Treg细胞到炎症组织受到抑制，而导致ITP的易感性。

总之，关于IL-23、Th17、CD4+CD25+CD127-Treg细胞与CCL-20协同作用参与了ITP的发病，目前尚未在基础实验中进行验证，对于疾病的诊断、治疗及预后方面的作用也未进行详细的验证，关于上述方面仍需进行深入探讨。