LC—MS/MS法测定粮谷中除草剂氯氨吡啶酸及氨氯吡啶酸残留量

张宏军，吴进龙，朱文达，郭明程，吴凤琪，王楼明，李 林

(1.农业农村部农药检定所，北京 100125；2.湖北省农业科学研究院植保土肥研究所，湖北 武汉 430064；3.深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心，广东 深圳 51800)

氯氨吡啶酸(Aminopyralid)和氨氯吡啶酸(Picloram)属于吡啶羧酸类的新型除草剂，广泛用于山地、草原、作物田和非耕地等的杂草防除[1]，我国在GB 2763-2016[2]《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定：油菜籽中氨氯吡啶酸临时管理限量为0.1mg/kg，谷物中氯氨吡啶酸的临时管理限量为0.1mg/kg，欧盟[3]规定蔬菜、水果、粮谷类等氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的最低限量均为0.01mg/kg，日本[4]对小麦、大麦、黑麦规定限量为0.01mg/kg。国际食品法典[5]规定了蔬菜、水果、谷物及肉制品中氯氨吡啶酸及氨氯吡啶酸的最大残留限量分别为0.1～0.3 mg/kg。

目前关于氯氨吡啶酸及氨氯吡啶酸的测定方法主要是液相色谱-质谱/质谱法等。美国EPA[6]制定了氨氯吡啶酸的LC-MS/MS检测方法，未有氯氨吡啶酸的检测方法报道，该方法需要对氨氯吡啶酸进行衍生化，操作费时、繁琐，且回收率和灵敏度偏低。其他国家包括我国尚未建立相关的检测标准。

Ying Ying-Tian[7]等发表了有关氯氨吡啶酸及毒莠啶的LC-MS/MS检测方法，该法采用C18色谱柱分离，负离子模式检测，但由于氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的极性较强，在传统的反相色谱条件下保留时间太短。刘勇良[8]等建立了氨氯吡啶酸的高效液相色谱分析法，但该方法适用于主成分测定，测定低限为7.3%，不适用于残留分析。孙星[9]等建立了氨氯吡啶酸的高效液相色谱-串联质谱法，但该方法仅适用小麦和土壤中氨氯吡啶酸的残留量，不能完全满足法规的要求。

本文拟将改进的QuEChERS方法[10]应用于样品前处理，采用LC-MS/MS测定食品中除草剂氨氯吡啶酸和氯氨吡啶酸残留量。方法简便、快速、准确、灵敏，且能满足相关法规对食品中氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸残留限量要求。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 氨氯吡啶酸(Picloram)和氯氨吡啶酸(Aminopyralid)标准品均购自sigma公司，纯度均>99.9%；实验用甲醇、乙腈均为色谱纯，购自Merck公司；甲酸为优级纯，sigma公司提供；实验用水为Mill—Q超纯水；QuEChERS试剂购自上海安谱科技公司。

1.2 仪器 API 4500串联质谱仪(美国AB公司)，配电喷雾电离源；IKA-T18匀浆机(德国IKA公司)；离心机(Allegra TMX-22R型，Beckman公司)；旋涡混合器(美国赛默飞公司)；氮吹浓缩仪(德国邦德公司)。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取 称取试样5.0g，精确至0.01 g，置于50mL离心管中，加入3 mL水，涡旋浸润样品后，加入10 mL 1%甲酸乙腈，28 000 rpm均质2min，再加入4g MgSO4、1g NaCl，漩涡振荡10 min，9 500 rpm离心3 min。

1.3.2 净化 取6mL上清液，加入预先加有150mg C18、900mg Na2SO4的15mL离心管中，漩涡振荡3 min，9 500 rpm离心5 min。移取2mL上清液于15mL离心管中，40℃氮吹至近干，用10%甲醇水溶液定容至1mL，涡旋混合，过0.22μm有机滤膜，供LC-MS/MS测定。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Eclipse Plus C18Column，1.8μm，2.1×50mm；柱温：30℃；进样量：5μL；流动相：A：0.2%甲酸，2mmol/L 乙酸铵水溶液，B：甲醇；流速：0.3mL/min；梯度(表1)。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

1.4.2 质谱条件 离子源：电喷雾电离(ESI+) ；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度:110℃ ；脱溶剂温度：350℃；气帘气压力：25 psi；喷雾气压力：55 psi；辅助加热气压力：55 psi；采用多反应监测(MRM) 模式。氨氯吡啶酸和氯氨吡啶酸的质谱采集参数(表2)。

表2 氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的监测离子对

2 结果与讨论

2.1 提取方法的选择 氨氯吡啶酸、氯氨吡啶酸结构为吡啶环外加羧基、氨基及不同数量的氯原子，极性强，且酸性也强，其PKa=2.3左右，采用1 %甲酸-乙腈(v/v)提取，可抑制酸性农药解离，有利于酸性农药向乙腈相转移，从而提高回收率。

聚类分析的结果能够反应高频关键词间的亲疏关系，揭示当期研究热点[7]。从图3聚类分析的部分结果可以看出，当前创客教育的主要研究内容如下。

以大米及小麦为基质，比较2种提取溶剂的提取效果即(1)1%乙酸-乙腈提取、无水硫酸镁及乙酸钠盐析。(2)乙腈提取、无水硫酸镁及氯化钠盐析，结果显示回收率有显著区别(表3)，故本实验采用加乙酸盐缓冲液的QuEChERS提取方法。

此外，为提高提取率，提取过程需要采用均质，为避免加入硫酸镁产生结块，加入酸化乙腈后就应立即均质，然后再加入无机盐，再行振荡。

2.2 分散吸附剂的选择与用量 QuEChERS方法是美国农业部于2003 年开发，代表食品分析中样品制备过程的快速、简便、廉价、高效、耐用和安全。这项技术非常简单，操作步骤少，对于复杂样品的净化非常有效。QuEChERS 技术多用来分析水果和蔬菜中的多类别、多残留农药，目前AOAC及欧盟均公布了官方QuEChERS标准，由于本次分析的目标物的极性和酸性均很强，传统的固相分散萃取技术不适用于本标准，故拟对其进行改进，选取常用的净化材料：C18，C18+GCB，C18+PSA，C18+PSA+GCB 4种净化材料，以100μg/kg加标水平，平行测定6次，考核每种净化材料条件下的待测物回收率(表4)。

表3 2种提取溶剂加标100μg/kg的回收率和相对标准偏差(n=6，RSD%)

表4 不同净化材料下加标100μg/kg的回收率和相对标准偏差(n=6,RSD%)

由结果可知 C18和C18+GCB净化效果较好，加入GCB回收率未有提高，但GCB对色素有很好的净化效果，故对色素含量高的样品选择C18+GCB作为净化材料，其他样品选用C18作为净化材料。

再考核C18的使用量。选取小麦及大米为基质，按照意见稿进行提取净化，其中净化剂C18分别加入50、100、150、200、250mg，GCB均加入50mg，平行测定6次，其他条件不变，测算氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的回收率(表5)。

表5 不同剂量净化材料下加标100μg/kg的回收率和相对标准偏差(n=6,RSD%)

结果表明C18用量为150 mg时净化效果最佳，加大用量不能提高净化效果，因此本文采用150 mg C18进行净化。

2.3 定容液的选择 由于待测物的极性较强，采用反相色谱对其分离时，需考察是否存在溶剂效应。定容液分别采用纯乙腈和初始流动相(10%甲醇/水溶液)时，结果(图1、图2)。

图1 纯乙腈定容液TIC图

图2 流动相(10%甲醇/水溶液)定容液TIC图

由图1、2可知待测物在纯有机相中存在较强的溶剂效应，故采用初始流动相(10%甲醇/水溶液)作为定容液。样品提取液需经氮吹，溶剂置换成流动相后上机检测，以减小测量误差。

2.4 基质效应 LC-MS/MS定量分析存在基质效应，在方法验证时应对基质效应进行评估。基质效应与基质的种类及基质干扰物的含量、分析物的特性、色谱分离条件、不同仪器离子源设计等有关，可按以下公式对基质效应进行量化评估：基质效应(ME，%)=[(基质匹配校准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率)-1]×100。|ME|<20%为弱基质效应，可忽略而无需采取补偿措施；20 %≤|ME|≤50 %为中等程度基质效应，|ME|>50%为强基质效应，须采取措施补偿基质效应。

按照1.3节进行前处理，配制基质匹配校准溶液，用流动相配制同浓度的纯溶剂标准系列并制作校准曲线，按以上公式计算的ME结果。结果表明：粮谷基质中氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸的|ME|>20%，因此须采用基质匹配标准溶液进行定量校准以补偿基质效应，确保定量结果准确。

2.5 线性范围和测定低限 在0～100 μg/L范围内配制浓度为5、10、20、50、100 μg/L的5组氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸系列标准溶液。以峰面积(y)为纵坐标，相应质量浓度(x，μg/L)为横坐标，绘制标准校正曲线，经软件分析可知，在0～100 μg/L范围内，氨氯吡啶酸及氯氨吡啶酸在液相色谱串联质谱仪上标准校正曲线的线性良好，相关系数均>0.999。

本方法的测定低限采用在不同基质中进行添加回收实际测定得到。氨氯吡啶酸和氯氨吡啶酸的测定低限均为0.01mg/kg，能满足目前国内外所有食品中的限量要求，符合SN/T 0001-2016《出口食品、化妆品理化测定方法标准编写的基本规定》和残留分析质量控制指南对测定低限的要求。

2.6 方法精密度和回收率 本研究的室内回收率和精密度实验，选用大米、小麦、荞麦、小米、大豆、高粱等样品基质，分别做3个不同水平的添加，添加量分别为10 、20 、100 μg/kg，4 ℃ 放置过夜，按建立的方法处理样品，每个浓度水平进行6次重复试验，测得的回收率和精密度(表6)。

表6 氨氯吡啶酸添加回收率及精密度试验结果(n=6)

3 结论

本文根据实际工作的需求，建立了测定粮谷中除草剂中氯氨吡啶酸及氨氯吡啶酸残留量的液相色谱串联质谱法。本方法前处理简单、灵敏度高、定量结果准确，本方法的测定低限为0.01 mg/kg，能够满足国内外现有法规要求，有很好的应用价值。