Alpha-熊果苷激活凋亡信号通路对人急性T细胞白血病细胞TIB-152异常增殖的调节作用①

字友梅 黄 琰 郭 燕 张 媛 王莉华 吕国庆 吴 隼

(新乡医学院第一附属医院血液一病区，卫辉453100)

白血病是一类骨髓中造血干细胞克隆增殖性疾病，常会出现细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等。白血病包括四种亚型：急性淋巴细胞性、急性髓细胞性、慢性淋巴细胞性和慢性骨髓性[1]。据统计2012年全世界白血病新增病例35.2万，占所有癌症病例的2.5%，居第11位；死亡病例26.5万，占所有癌症死亡病例的3.2%，居第10位[2]。白血病是中国十大癌症之一，2012年白血病死亡病例5.2万，占全球白血病死亡病例的19.7%[3]。白血病的治疗是一个亟待解决的重要医学问题。研究表明许多草药及植物果实有利于白血病的治疗[4]。熊果苷(对-羟基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷)是一种天然的多酚类物质，属于氢醌葡萄糖苷化合物，具有2种异构体即alpha-熊果苷和beta-熊果苷，首先发现于熊果干燥的叶子中，是常见的黑色素合成抑制剂，在化妆品行业被广泛用作美白成分[5]。除此之外熊果苷还有许多其他的功能，例如杀菌，抗炎等[6]。但alpha-熊果苷在白血病中的作用研究还很缺乏。本研究的主要目的是探究alpha-熊果苷对人急性T细胞白血病细胞TIB-152增殖和凋亡的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1细胞系与主要试剂 急性淋巴细胞白血病细胞系TIB-152购自美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。Alpha-熊果苷(分析纯)购自Sigma公司。培养基RPMI1640和胎牛血清购自赛默飞世尔科技公司。CCK-8试剂盒来源于日本同仁化学公司。细胞凋亡检测试剂盒Annexin V Apoptosis Detection Kit购自美国BD公司。抗B细胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2,Bcl 2)抗体，抗Bcl 2相关蛋白X (Bcl-2-associated X protein,Bax)抗体，抗 Cleaved caspase-3抗体和抗Cleaved caspase-9抗体购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与药物处理 TIB-152细胞于添加了10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。当细胞增殖到约80%时进行传代。用不同浓度(0、 0.1、 0.2、 0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 μmol/L)的alpha-熊果苷处理TIB-152细胞48 h后通过CCK-8检测细胞毒性。后续实验TIB-152细胞分为4组：TIB-152 (对照组)；alpha-熊果苷(10、20、50 μmol/L)组。

1.2.2CCK-8检测细胞增殖 用10、20、50 μmol/L的alpha-熊果苷处理TIB-152细胞后，每天检测各组细胞的增殖倍数。首先用培养基将CCK-8溶液稀释到10%，再用上述溶液制成1×106个/ml的细胞悬液；然后于37℃恒温培养箱中培养4 h，最后检测450 nm处吸光值，计算细胞增殖倍数。

1.2.3流式细胞术分析细胞凋亡 用10、20、50 μmol/L的alpha-熊果苷处理TIB-152细胞48 h后检测细胞凋亡率。首先1×的Binding buffer将待测细胞制成1×106个/ml的悬液。然后用Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色15 min，最后利用流式细胞仪对染色的细胞进行检测，计算细胞凋亡率。

1.2.4蛋白印迹 在10、20、50 μmol/L的alpha-熊果苷处理TIB-152细胞48 h后，首先用PBS将待测细胞清洗3次，再入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，100℃变性5 min。等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，然后用5%的BSA封闭1 h，再加入相应的一抗，4℃过夜孵育，第2天加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。最后加入发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量。

1.3统计学分析 用SPSS16.0软件进行统计学分析，两两比较用独立的t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Alpha-熊果苷对TIB-152的细胞毒性检测 通过CCK-8检测不同浓度alpha-熊果苷处理TIB-152后的细胞活力，分析alpha-熊果苷对TIB-152的细胞毒性。图1B显示，当alpha-熊果苷处理浓度<50 μmol/L 时，TIB-152的细胞活力可维持在80%以上，未产生明显的细胞毒性；但当alpha-熊果苷处理浓度>50 μmol/L时，TIB-152的细胞活力急剧下降，均在80%以下。由此可见，<50 μmol/L的alpha-熊果苷对TIB-152没有明显的细胞毒性，>50 μmol/L的alpha-熊果苷会对TIB-152产生细胞毒性。

2.2Alpha-熊果苷对TIB-152细胞增殖的影响 为分析alpha-熊果苷对TIB-152细胞增殖的影响，利用CCK-8检测细胞增殖倍数。如图2所示，10 μmol/L的alpha-熊果苷组与对照组细胞增殖倍数无明显变化。与对照组相比，50 μmol/L的alpha-熊果苷组细胞增殖倍数明显降低(P<0.01)。以上结果说明，alpha-熊果苷可减弱TIB-152细胞增殖。

图1 Alpha-熊果苷化学结构式(A)和alpha-熊果苷对TIB-152 (B)和正常的PBMC (C)细胞活力的影响Fig.1 Chemical structure of alpha-Arbutin (A) and effect of alpha-Arbutin on cell viability of TIB-152 (B)and normal PBMC cells (C)

图2 CCK-8检测细胞增殖Fig.2 Proliferation was detected by CCK-8Note: **.P<0.01 vs.control group.

图3 流式细胞术检测细胞凋亡Fig.3 Apoptosis was detected by flow cytometryNote: A.Scatter diagram of flow cytometry；B.Histogram of flow cytometry，**.P<0.01 vs.control group.

图4 蛋白印迹检测Bax和Bcl-2表达Fig.4 Expression of Bax and Bcl-2 was tested by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot；B.Histogram of Western blot.**.P<0.01 vs control group.

图5 蛋白印迹检测Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表达Fig.5 Expression of Cleaved caspase-3 and Cleaved caspase-9 was measured by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot；B.Histogram of Western blot.**.P<0.01 vs.control group.

2.3Alpha-熊果苷对TIB-152细胞凋亡的影响 通过流式细胞术检测细胞凋亡率，分析alpha-熊果苷对TIB-152细胞凋亡的影响。由图3可知，50 μmol/L的alpha-熊果苷组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01)。上述结果表明，alpha-熊果苷可增强TIB-152细胞凋亡。

2.4Alpha-熊果苷对TIB-152细胞Bax/Bcl-2 表达的影响 利用蛋白印迹检测Bax和Bcl-2表达，分析alpha-熊果苷对TIB-152细胞Bax/Bcl-2 蛋白比值的影响。图4显示，50 μmol/L的alpha-熊果苷组Bax/Bcl-2比值显著高于对照组(P<0.01)。由此可见，alpha-熊果苷可提高TIB-152细胞Bax/Bcl-2 蛋白比值。

2.5Alpha-熊果苷对TIB-152细胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表达的影响 通过蛋白印迹分析alpha-熊果苷对TIB-152细胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表达的影响。如图5所示，50 μmol/L的alpha-熊果苷组Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表达显著高于对照组(P<0.01)。以上结果说明，alpha-熊果苷可上调TIB-152细胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表达。

3 讨论

目前对T细胞白血病的主要治疗方法包括：化疗、造血干细胞移植、免疫疗法、分子靶向治疗等[7]。但这些方法都存在一些缺陷，挖掘新的白血病治疗药物具有重要意义。大量文献报道植物提取物在各类疾病治疗中具有积极作用[8-10]。

细胞增殖的不受控是癌细胞的普遍特征。研究表明许多植物提取物都可调控癌细胞的增殖。有数据显示梓醇(一种环烯醚萜葡萄糖苷化合物)具有抑制卵巢癌细胞及乳腺癌细胞增殖的功效[11,12]。有研究发现在白血病HL60细胞中，沙棘提取物可抑制细胞增殖[13]。据报道肉桂叶提取物可减弱白血病细胞THP-1增殖[14]。熊果苷是目前美白化妆品的主要原料，质量浓度一般在0.07～50 mg/L。近年来还发现熊果苷对癌症的治疗也具有积极作用。有数据表明熊果苷可抑制膀胱癌细胞增殖[15]。本文结果显示，alpha-熊果苷可明显减弱人急性T细胞白血病TIB-152细胞增殖。

细胞凋亡的受阻是癌症的主要特征之一。越来越多的研究表明植物提取物在抗癌细胞凋亡方面发挥着积极作用。有数据显示大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷可提高卵巢癌细胞凋亡[16]。Jin等[17]发现梓醇可促进膀胱癌细胞凋亡。据报道TIB-152细胞中，百足草提取物可诱导细胞凋亡[18]。有研究发现白花蛇舌草提取物可诱导白血病HL60细胞凋亡[19]。据报道熊果苷可促进B16黑色素瘤细胞凋亡[20]。本研究结果显示，alpha-熊果苷可增强TIB-152细胞凋亡。但有研究显示熊果苷有保护U937淋巴瘤细胞免于电离辐射诱导的凋亡的作用[21]。这可能是由于熊果苷存在2种同分异构体：α型和β型，这2种同分异构体的不仅在物理化学性质方面存在一定的差异，在功能方面也存在差异[22-24]。另一方面可能是由于作用的时间、浓度、细胞系及细胞所处的环境的不同造成的。

在线粒体介导的细胞凋亡信号通路中Bax、Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3都是关键性因子[25]。许多植物提取物可影响这些细胞凋亡信号通路相关蛋白的表达。有研究发现黄柏酮葡萄糖苷及槲皮素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷均可提高前列腺癌细胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，增强Caspase-3表达[26,27]。据报道茯苓提取物可提高白血病U937细胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，上调Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9表达[28]。Sung等[29]发现紧密小鹰芹提取物可提高白血病HL60细胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，增强Caspase-3和Caspase-9表达。本文结果显示，alpha-熊果苷可提高TIB-152细胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，上调Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表达。

本研究表明，在人急性T细胞白血病TIB-152细胞中，alpha-熊果苷可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，提高Bax/Bcl-2 蛋白比值，增强Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表达。综上所述，alpha-熊果苷可激活凋亡信号通路抑制人急性T细胞白血病细胞TIB-152细胞增殖，促进细胞凋亡。下一步计划进行体内实验研究alpha-熊果苷对急性T细胞白血病发生发展的影响。