阿胶、黄明胶对被动吸烟小鼠肺脏Th17/Treg细胞亚群分化及相关细胞因子表达的影响差异①

张 喆 胡晶红 姚成芳 兰红云 张永清

(山东中医药大学,济南250355)

阿胶(Colla Corii Asini)是我国传统的名贵中药，自《神农本草经》首载至今已有两千多年的药用历史[1]。根据文献记载：阿胶产生之初原料为牛皮，后因历史原因被驴皮取代并沿用至今，而牛皮胶改称黄明胶(Colla Corii Bovis)[2]。阿胶和黄明胶制作工艺相似，但药理功效和临床适应症却各有侧重[2,3]：除同时具有止血功效外，阿胶在临床上用于治疗肺燥咳嗽，眩晕心悸，心烦不眠等症，黄明胶口服治疗体虚便秘、肾虚遗精，外用对跌打损伤、疮痈肿毒有很好的治疗效果。中医本草类古籍中有诸多关于阿胶和黄明胶治疗气道炎症的记载，如《本草汇》中阿胶项下有“治喘嗽者，不论肺虚肺实，可下可温，须用以安肺润肺”的记载；《证类本草》中黄明胶项下有“治咳嗽不瘥者，黄明胶炙令半焦为末，每服一钱匕”的记载[2，3]，但中医理论以“驴皮色黑属阴，阿井之水千里所注，清而且重，其性下趋，故止虚劳咳嗽”、“黄明胶气味与阿胶同，但非阿井水及驴皮同造,故不能疏利下行耳”为依据，认为黄明胶治疗气道炎症效果不及阿胶，二者对气道炎症的治疗效果及作用机制比较却均未见现代研究报道。随着对黏膜免疫研究的不断深入，发现吸烟作为许多呼吸道疾病如慢性阻塞性肺炎(COPD)、哮喘及呼吸道感染的主要危险因素可能与香烟烟雾改变宿主的免疫反应有关[4,5]，辅助型T细胞(T hell cell)亚群参与机体适应性免疫，在气道炎症性疾病中扮演着重要角色[6]，除早期发现的Th1/Th2细胞亚群外，Th17/Treg细胞亚群功能平衡被认为是影响呼吸道炎性因子分泌及促炎症反应的关键因素[7,8]。因此，本研究建立被动吸烟小鼠模型，从Th17/Treg细胞亚群比例及相关细胞因子表达角度研究阿胶和黄明胶治疗气道炎症作用机制的异同。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂

1.1.1实验动物 SPF级雄性C57BL/6小鼠32只，体质量18～22 g，6～8周龄，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[SYXK(鲁)20140007]，26℃、12 h 光照，12 h暗室饲养，自由进水、进食,Co60辐照灭菌全营养大小鼠饲料。

1.1.2主要试剂及仪器 抗小鼠荧光抗体:PE-CD3、percp-CD4、APC-cy7-IL-17A、PE-cy5.5-CD25、PE-Foxp-3均购自eBioscience公司；TRIzol Reagent、2×Es Taq Master-Mix、dNTP、RNase、5×Buffer购自北京康为世纪生物科技有限公司；M-MLV购自Invitrogen公司；RNA酶抑制剂购于BioBasic公司；二乙基焦碳酸酯(DEPC)、琼脂糖购于AMRESCO公司；丙酮、氯仿、异丙醇、无水乙醇购于天津广成化学试剂有限公司；内参照GAPDH、Foxp-3、ROR-γ引物由上海博尚生物技术有限公司合成，引物序列见表1；RIPA裂解液购自Beyotime公司；ELISA IL-17A、ELISA IL-6、ELISA TGF-β1试剂盒均购于联科生物技术有限公司。梯度PCR扩增仪(Tgradient，Biometra，德国)；凝胶成像系统(Alplha ImagerTM 2200，美国)；电泳仪、酶标仪(Thermo，美国)；FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司)。

1.2实验方法

1.2.1气道炎症动物模型建立方法 32只小鼠按随机数字法平均分成对照组、模型组、阿胶组和黄明胶组。除对照组外，其余各组每日两次香烟烟熏，烟熏量10支/次(将军烟：焦油量11 mg，烟碱含量：1.1 mg，一氧化碳量：11 mg，山东中烟工业有限责任公司)，具体方法为：每次点然5支香烟插入40×30×20 cm3自制烟熏箱自然燃尽,每次2组，共10支香烟，烟熏时间共30 min，两次烟熏间隔 4 h以上，阿胶组小鼠每日给予0.2 ml浓度为0.2 g/ml 阿胶溶液灌胃，黄明胶组小鼠每日给予0.2 ml浓度为0.2 g/ml 黄明胶溶液灌胃，模型组小鼠每日0.2 ml 生理盐水灌胃，按上述方法造模24周后进行实验。

表1RT-PCR引物序列

Tab.1RT-PCRprimersequence

GenePrimer sequenceProductlengthGAPDH5'ACCACAGTCCATGCCATCAC4523'TCCACCACCCTGTTGCTGTAFoxp35'CCCATCCCCAGGAGTCTTG1833'ACCATGACTAGGGGCACTGTAROR-γ5'ACAGGGAGCCAAGTTCTCAGT1903'TCGGTCAATGGGGCAGTTCT

1.2.2检测指标及实验方法

1.2.2.1外周血细胞分类计数 眼球取血约1.0 ml 收集于加入EDTA-2Na的抗凝管中，缓缓摇晃使血液充分与抗凝剂接触，取100 μl加到EP管中，使用pocH-100iv血细胞分析仪检测血细胞成分。

1.2.2.2酶联免疫吸附法(ELISA)测定ELISA血清IL-17A、IL-6、TGF-β1因子蛋白表达 眼球取血约1.0 ml收集于EP管中，离心(4 000 r/min，15 min，4℃)取上清，按照ELISA试剂盒的操作说明检测IL-17A、IL-6、TGF-β1因子蛋白水平。

1.2.2.3肺脏HE染色切片观察病理改变 小鼠取血后脱颈椎处死，无菌分离肺脏组织。左肺上叶置于4%甲醛溶液中固定72 h，按照常规方法制作石蜡切片，HE染色评价其病理改变。

1.2.2.4逆转录-PCR检测肺脏Foxp-3、ROR-γ 因子转录水平 小鼠左肺下叶置于经DEPC处理的EP管中，采用TRIzol Reagent提取样本总mRNA，采用oligo dT为RT反应引物，PCR反应条件:RNase free water 6.5 μl，Taq酶12.5 μl，RT反应产物4 μl，上、下游特异性引物各1 μl，总体积20 μl。PCR循环参数:预变性95℃，5 min；94℃，1 min;58℃，1 min；72℃，1 min，30个循环，末次循环后72℃延长10 min。PCR产物经1.2%凝胶电泳，结果采用 Alpha凝胶成像系统分析图像，以GAPDH为内参照，计算目的基因与同步GAPDH灰度值比值作为相对表达量。

1.2.2.5流式细胞术检测肺脏Th17及Treg细胞 小鼠右肺经过消化、研磨、破红、过滤等操作制备单核细胞悬液，调整单个核细胞浓度(1×106/管)后离心，沉淀用1.5 ml刺激液重悬，置于细胞培养箱中37℃，5%CO2，刺激培养6 h后收集细胞，经滤网过滤后转移至EP管中，1×PBS洗2次，离心后弃上清，沉淀加入小鼠血清重悬后室温避光封闭15 min，按说明书参考抗体浓度加入外标抗体(PE-CD3、percp-CD4、percp-cy5.5-CD8、PE-cy5.5-CD25)，4℃避光孵育30 min；1×PBS洗2次，加入穿膜固定液500 μl， 4℃固定30 min，固定后细胞用穿膜液洗2次后加入500 μl穿膜液4℃避光孵育30 min，按说明书加入内标抗体(APC-cy7-IL-17A、PE-Foxp-3)，4℃避光孵育30 min后分别用1×Perm Wash和1×PBS各洗1遍，随后上机检测，采用Flowjo7.6分析Th17 亚群(CD3+CD4+IL-17A+)及Treg亚群(CD3+CD4+CD25+Foxp3+)比例。

2 结果

2.1小鼠外周血血细胞分析 与对照组相比，模型组小鼠外周血白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板及血红蛋白含量均升高(P均<0.05)，淋巴细胞数量降低(P<0.05)；阿胶能够显著降低中性粒细胞数(P<0.05)，黄明胶能够显著降低嗜酸性粒细胞数(P<0.05)，两组红细胞、血小板及血红蛋白含量均显著回落，显示阿胶和黄明胶能够使肺脏组织缺氧状态得到有效缓解。见表2。

2.2阿胶、黄明胶对被动吸烟小鼠血清 IL-17A、IL-6 、TGF-β1 因子表达的影响 血清ELISA检测结果显示：被动吸烟小鼠肺脏IL-17A、IL-6、TGF-β1因子表达均显著升高(P均<0.05)；阿胶能够降低IL-17A、IL-6、TGF-β1蛋白表达(P<0.05)；黄明胶对IL-17A、IL-6因子影响均不显著，但可显著降低TGF-β1蛋白水平(P<0.05)，结果见表3。

GroupWBC(103/μl)LYM(103/μl)Neutrophil(103/μl)Eosinophils(103/μl)PLT(g/dl)HGB(g/L)RBC(106/μl)C4.07±0.451.84±0.201.74±0.090.61±0.1114.46±0.5616.6±1.810.5±1.4M4.95±0.631)1.51±0.391)2.57±0.111)0.69±0.1216.90±0.661)18.8±2.31)12.6±1.91)E4.36±0.402)1.87±0.241.99±0.122)0.60±0.0214.61±0.722)17.3±1.92)11.2±1.82)H4.71±0.511.94±0.292.42±0.210.51±0.022)16.37±0.6917.0±2.02)11.7±2.02)

Note：C.Control group;M.Model group;E.Colla Corii Asini group;H.Colla Corii Bovis group.Compared with control group，1)P<0.01;compared with model group，2)P<0.05.

2.3小鼠肺组织病理切片分析 肺脏切片HE染色显示：对照组为正常肺组织结构，模型组肺间质有大量炎性细胞浸润，有红细胞渗出，肺间质明显增厚，气道管壁增厚、管腔变窄；阿胶组和黄明胶组炎性细胞浸润程度明显降低，无红细胞渗出，肺间质增厚不明显，气道管壁增厚、管腔变窄情况明显改善，其中阿胶对肺脏炎症的治疗效果较黄明胶更为显著，结果见图1。

2.4阿胶、黄明胶对被动吸烟小鼠肺脏RORγt、Foxp3因子转录水平的影响 RT-PCR检测结果显示：模型组小鼠肺脏RORγt 及Foxp3 mRNA表达均显著升高(P均<0.05);阿胶可显著降低RORγt mRNA表达，同时Foxp3 mRNA表达随之降低(P<0.05)；与模型组相比，黄明胶组RORγt mRNA表达降低，Foxp3 mRNA表达升高，但差异均无显著(P>0.05)，结果见图2。

2.5阿胶、黄明胶对被动吸烟小鼠肺脏Th17、Treg细胞亚群的影响 与对照组相比，模型组小鼠肺脏Th17 亚群(CD3+CD4+IL-17A+细胞)比例及细胞数目均显著升高，Treg 亚群(CD3+CD4+CD25+Foxp3+细胞)比例及细胞数目显著升高；与模型组相比，阿胶组Th17 亚群及Treg 亚群比例和细胞数目均显著降低(P均<0.05)，黄明胶组Th17 亚群及Treg 亚群比例及细胞数目均未发生显著变化(P>0.05)，结果见图3。

GroupsIL-17A(ng/L)IL-6(ng/L)TGF-β1(ng/L)C39.72±2.3637.41±3.8932.52±3.75M50.40±4.931)46.47±5.301)41.58±4.961)E42.63±3.072)38.08±5.862)33.33±3.142)H50.57±3.3448.81±4.9725.33±3.142)

Note：C.Contol group；M.Model group;E.Colla Corii Asini group;H.Colla Corii Bovis group.Compared with control group，1)P<0.01;compared with model group，2)P<0.05.

图1 小鼠肺脏组织切片(×200)Fig.1 Paraffin sections with H&E staining of mice lung tissue(×200)Note: C.Contol group,M.Model group;E.Colla Corii Asini group;H.Colla Corii Bovis group.C1，M1，E1，H1.Inflammatory cell infiltration in lung tissue in each group；C2,M2，E2，H2.Airway inflammation in lung tissue in each group.

图2 阿胶、黄明胶对被动吸烟小鼠肺脏RORγt、Foxp3因子转录水平的影响Fig.2 Effect on expression of RORγt，Foxp3 mRNA of Colla Corii Asini and Colla Corii Bovis in mice with chronic cigarette smoke exposureNote: C.Control group;M.Model group;E.Colla Corii Asini group;H.Colla Corii Bovis group.Compared with control group，*.P<0.01;compared with model group，#.P<0.05.

图3 阿胶、黄明胶对被动吸烟小鼠肺脏Th17、Treg细胞亚群比例及细胞数目的影响Fig.3 Effects of Colla Corii Asini and Colla Corii Bovis on balance of Th17/Treg cell subsets in lungs of mice with chronic cigarette smoke exposureNote: C.Control group;M.Model group;E.Colla Corii Asini group;H.Colla Corii Bovis group.Compared with control group，*.P<0.01;compared with model group，#.P<0.05.

3 讨论

众所周知，吸烟是哮喘、肺气肿、慢性阻塞性肺炎(COPD)等呼吸道疾病发生的主要危险因素[9]。近年来，随着人们对吸烟危害的认知程度加深，吸烟率呈现逐年下降趋势，但大气细颗粒物(Fine particulate matter，PM2.5)污染问题日益严重，已成为人类呼吸系统面临的新挑战[10]。香烟烟雾引发呼吸道疾病的作用机制十分复杂，目前仍未完全阐明，局部免疫失调导致的持续炎症反应在疾病的形成、发展及转归中的重要作用被国内外诸多动物及人类研究所证实[11-13]，其中，Th17/Treg细胞亚群平衡及相关细胞因子表达在慢性气道炎症性疾病发病机制中的作用是当前的研究热点[14,15]。Th17细胞亚群主要分泌IL-17A等细胞因子促进中性粒细胞聚集和活化，导致机体产生强烈的炎症反应,参与多种炎症性疾病和自身免疫性疾病，特异性转录因子ROR-γt在诱导Th17亚群分化中发挥主导作用；CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)是一类起负调节作用的CD4+CD25+T细胞亚群，能够抑制T淋巴细胞活化，在维持免疫耐受中起着关键性作用，叉头状转录因子3(Foxp3)作为其特征性标志同时也参与其分化和发育。两类细胞均来自初始CD4+T细胞，其分化过程受多种细胞因子共同调节，调控机制仍未完全明确。当前被多数研究者接受的观点为：当TGF-β与IL-6同时存在时，初始T细胞向Th17细胞分化，而只有TGF-β的情况下，初始T细胞向Treg细胞分化。两类细胞在分化过程中互相遏制，功能上相互拮抗，对于维持体内内环境的稳定至关重要[16-18]。当呼吸道黏膜上皮细胞接触到有害颗粒物后，被激活的抗原提呈细胞分泌大量IL-6等前炎性细胞因子，在趋化中性粒细胞的同时，上调RORγt表达，Th17亚群特异性趋化转录因子RORγt诱导初始T细胞向Th17细胞分化，加重Th17介导的炎症反应，增加的Th17细胞分泌大量IL-17A等促炎细胞因子，募集中性粒细胞和巨噬细胞浸润至炎症组织释放弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶破坏肺组织，刺激更多炎性介质释放；而活化的T细胞和损伤细胞修复过程中分泌大量TGF-β促进细胞外基质沉积，诱导气道重塑和纤维化的发生。Treg细胞亚群通过分泌IL-10等细胞因子抑制T淋巴细胞活化，在炎症反应中表达上调发挥抗炎保护作用，但体内Treg细胞表达上调会抑制其他免疫细胞对癌细胞的监视作用，说明即使未出现肺功能改变，吸烟也是引发肿瘤产生的重要危险因素[19]。

前人研究显示Th17/Treg细胞及相关细胞因子在吸烟诱导的气道炎症中的作用机制十分复杂，实验结果的差异可能因个体耐受程度不同而有所差异，同时我们也发现不同的模型构建方法虽然能得到相似的病例改变，但作用机制可能有所差异，如在建立动物模型探索COPD的发病机制时，单独应用香烟烟雾与烟熏联合脂多糖(LPS)滴鼻，以及香烟烟雾暴露的方法及烟雾剂量、小鼠品系选择等对结果均产生很大影响。一直以来，阿胶以“补血圣药”著称，对各种出血症及贫血有显著疗效，现代研究也逐渐揭开了阿胶抑制癌细胞增殖、协助放化疗后机体免疫重建、抗休克、抗疲劳、美容等药理功效的作用机理[3]。但是作为治疗肺阴虚咳嗽的常用药，阿胶治疗气道炎症的作用机制鲜有研究报道。因此，为探明阿胶和黄明治疗呼吸道炎症的效果及作用机制的异同，同时发掘中药抗雾霾的药理功效，本研究采用较低剂量香烟烟雾连续暴露方式建立动物模型，且未使用脂多糖诱导急性炎症反应，意图模拟大气细颗粒物和被动吸烟时低浓度有害气体的致病环境，在此基础上从组织、细胞、分子层面上探讨阿胶和黄明胶对气道炎症小鼠肺脏保护作用。结果显示：C57BL/6小鼠经过24周低剂量香烟烟雾暴露后肺间质有大量炎性细胞浸润，肺泡破裂融合，出现红细胞渗出，气道上皮细胞在烟雾颗粒刺激下IL-6、TGF-β等前炎性因子表达显著升高，诱导中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润造成基质损伤，同时通过上调转录因子RORγt表达促进Th17细胞亚群分化，细胞因子IL-17A表达升高；组织的不断损伤和修复导致肺间质明显增厚，气道管壁增厚、管腔变窄等气道重塑过程的发生，导致呼吸功能受到影响；同时，在低浓度香烟烟雾引发的慢性气道炎症中，Treg细胞亚群及转录因子Foxp3表达上调，原因可能是机体免疫系统通过上调Treg细胞抑制机体过强的免疫反应来保护宿主，避免因过强的免疫反应造成严重病理损害。本研究显示：阿胶通过下调细胞因子IL-6、TGF-β及转录因子RORγt的表达降低小鼠肺脏Th17细胞亚群比例及数目从而减轻气道炎症程度，Foxp3因子表达和Treg细胞比例及数目相应降低，肺脏病理切片显示炎症情况得到明显改善，无红细胞渗出，肺间质增厚、气道管壁增厚、管腔变窄情况明显改善。在本研究中，尽管病理切片显示黄明胶能有效减轻香烟烟雾导致的肺脏炎症，但细胞及细胞因子检测未显示黄明胶对IL-6、IL-17A因子表达及Th17细胞的抑制作用，肺脏Treg细胞比例及转录因子Foxp3表达出现较小幅度的上调，而对于Th17亚群和Treg亚群重要的活化因子，黄明胶组小鼠血清TGF-β水平却呈现显著下降，与其余研究结果相矛盾，出现这一结果的原因可能与血清TGF-β与其在肺脏的表达并不是完全统一，亦有可能是由于实验误差或取样方法有关，需要进一步实验进行验证；同时，黄明胶治疗气道炎症的效果不及阿胶，说明古籍中“黄明胶气味与阿胶同，但非阿井水及驴皮同造,故不能疏利下行耳”虽是从中医理论角度进行阐释，但仍具有一定科学性。另外，本研究选择的实验动物给药剂量是按照阿胶和黄明胶药品说明书中成人用药剂量的中等水平换算而来，阿胶和黄明胶对Th17/Treg细胞分化的影响是否与给药剂量有关仍需进一步研究确定。