猪繁殖与呼吸综合征与猪δ冠状病毒病混合感染的诊断

冯 宇，徐志文，朱 玲

（四川农业大学动物医学院动物生物技术中心，四川 成都 611130）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以感染猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、产弱胎和木乃伊胎等为特征的高度传染性疾病，各种年龄猪只均可感染，尤其以仔猪最易感[1]。

猪δ冠状病毒病的病原为猪δ冠 状 病 毒（PDCOV），2009-2011年PDCOV在中国香港首次报道[2]；PDCOV与猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等同属于冠状病毒，且均能引起猪群发生腹泻，发病症状相似，不同的是PDCOV引起的腹泻症状会相对较轻，贺东生[3]在2015年报道发现PDCOV-ch A毒株，证明我国也受到PDCOV的感染，且存在零星性而非暴发性。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2018年3—4月在四川农业大学动物生物技术中心进行。

1.2 病料采集

本次通过临床诊断和剖解病理变化的观察，对疾病初步判定为猪蓝耳病和猪δ冠状病毒病，针对该两种疾病无菌采集相关病变严重的器官、组织。分别采集5头猪的肺脏、肺门淋巴结以及小肠，分别编号为1号、2号、3号、4号、5号，带回实验室进行病原诊断。

1.3 主要试剂

TaqDNA 聚合 酶 购自宝生物工程（大连）有限公司、DNA Marker DL 2000、Trizol、Taq PCR Master Mix（2×，blue dye）、PrimeScript RT Rragent Kit(反转录试剂盒)购自宝生物（大连）有限公司。

1.4 引物合成

根据GenBank已登录的PDCOV（KX022604.1）、PRRSV（JX512910.2）基因的核苷酸序列，利用Primer Blast各设计一对引物（表1）。引物由生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 病毒总RNA的抽提及PCR的扩增

组织样品分别放入匀浆器里，编号后加1 mL Trizol 裂解液进行匀浆，充分匀浆后室温静置 5 min，12000 r/min，离心5 min；取上清液，加入200 µL 氯仿迅速振荡，室温静置 5 min，12000 r/min，离心15 min；向最后获得的上清液中加入等量异丙醇沉淀RNA，轻轻摇晃混匀，室温作用10 min后，12000 r/min 离心 15 min，弃上清液，加1 mL 700 mL/L 冰乙醇，12000 r/min 离心5 min，轻轻弃去无水乙醇，自然风干，溶解于40 µL无Rnase 水中，-20 ℃保存备用。按照宝生物工程（大连）有限公司 RTPCR 试剂盒说明书合成 cDNA，将反转录产物于-20 ℃保存备用。

以表1的两对引物为检测引物PCR反应程序分别为：PDCOV：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个 循 环；72 ℃ 终 延伸 10 min；PRRSV：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。反 应 体 系 均 为 ddH2O 3µL，2×Taq PCR Master Mix 5 µL，上 下 游 引 物 各 0.5 µL， 模 板cDNA 1µL，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 目的片段的基因测序

将PCR产物送至生物工程（上海）股份有限公司进行测序，并将测序结果与NCBI上的PDCOV和PRRSV参考序列进行对比，分析产物的同源性。

表1 引物序列与产物长度

2 结果

2.1 临床症状

发病猪体温升高，患猪浑身无力、消瘦，喘气，抽搐，站立不稳，腹泻，精神沉郁，昏睡，腹式呼吸且粪便成黄色水样，见图1。

图1 病猪临床照片

2.2 剖检病变

剖检5头发病猪，主要病变表现为小肠扩张，肠壁变薄、透明，内充满淡黄色液体，有的小肠黏膜有出血点，浆膜层黄色米粒的结节，且肺部出现实变、肺门淋巴结肿大等，见图2。

图2 部分病猪小肠病变剖检图

2.3 病原学检测

以1.5中获得的cDNA为模板，1.4中合成的引物进行PCR扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，所扩增的产物大小与预期大小一致。

2.4 目的片段的基因序列验证

采用RT-PCR方法扩增目的片段，并对产物测序，所得序列经 NCBI BLAST比较分析，结果显示：PRRSV的扩增序列与参考毒株（JX512910.2）的相同度为99%，PDCOV的扩增序列与参考毒株（KX022604.1）的相同度为99%。证实本次导致猪群死亡的病原主要为PRRSV和PDCOV，属于二者混合感染。

3 讨论

现无论是大型猪场还是散养户都无法避免PRRS的感染，其部分原因在于病毒毒株的高变异性，且发病机制往往取决于多种因素，而重要原因还是该病会导致机体免疫缺陷，从而继发感染其他疾病，使治疗变得更加困难[4]。对于本次该猪场暴发PRRSV与PDCOV的混合感染，可能原因是该猪场未能正确防控PRRSV，一方面由于变异毒株的产生，传统的疫苗接种有时不仅达不到防控效果，甚至还可能引起反向作用，增大猪场对PRRSV的防控压力，各个猪场应理性分析本猪场的PRRSV所属类型，按照自己猪场生产经营模式制定不同的疫苗免疫程序，而非按部就班；另一方面，PRRSV可引起机体的免疫缺陷，使得其他病毒或细菌“有机可乘”，本次案例中猪群感染PDCOV可能是因为猪群在感染PRRSV后免疫力低下引起，所以不管任何猪场一定要重视PRRS，加强对该病的防控，落实好每一次疫苗免疫，以及抗体水平的检测。

图3 电泳检测结果

PDCOV是近几年来新发现的引起猪腹泻的病毒性病原。该猪场在发生PRRSV的基础上，发生严重腹泻，经实验室检测为PDCOV，且与参考毒株KX022604.1的同源性高达99%，而与香港毒株HKU15-155同源性低，表明我国PDCOV毒株可能与美国毒株有亲本关系，这与贺东生[3]等的研究相一致，但由于该病毒报道少，国内各研究所分离毒株数量少，至今尚未有可用的疫苗。美国提倡加强对猪群的饲养管理，建立完善的生物安全体系，饲喂营养丰富的全价饲料，保证猪只膘肥体壮，提高机体的免疫力与抗病力，以防止该病的发生与流行。由于该病的机制和症状与猪流行性腹泻类似，猪场可以按照防控猪流行性腹泻的方法来防控猪δ冠状病毒病。

总之，猪场应以防为重，除了加强饲养管理，落实生物安全措施之外，还应做好免疫预防和药物保健预防。