基于响应面法对白地霉M5高产酯发酵工艺优化

田宇敏，贾丽艳,*，高娟娟，郭晋田，王军燕，甄晓君

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；2.山西杏花村汾酒厂股份有限公司，山西 汾阳 032209；3.山西潞城市圣堂食品有限公司，山西 潞城 047500)

食醋，作为历史悠久的传统调味品深受广大消费者的喜爱。作为调味品，食醋的风味在很大程度上决定了食醋的品质[1]。影响食醋风味的物质种类丰富，包括酸、酯、醇、酮、吡嗪等。其中酯对于食醋的风味有重要影响，是食醋品质优劣的主要考察指标之一[2]。主要的酯类包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、醋酸苯乙酯及乙酸丁酯等[3]，能够赋予食醋果香和乳香等特殊香气。因此，对食醋中酯类物质含量及组成的调控具有重要意义。

国内外研究者对食醋的风味进行了大量的研究，发现微生物菌种在传统酿造食品中起着决定性的作用[4]。白地霉(Geotrichumcandidum)是一类形态特征介于酵母菌和霉菌之间的真核微生物[5]。近年来，针对白地霉的产香特性，国内外有很多应用白地霉作为商品的报道，如：香精香味添加剂[6,7]、奶酪的后熟发酵[8,9]、菜籽油[10]、啤酒等[11]，但在食醋方面的研究甚少。本课题组从酒醅中分离得到1株具有高产酯能力并产特殊香气成分的白地霉M5，通过采用HS-SPME-GC-MS分析其固态发酵主要香气成分，检测出多种物质具有食醋的特征香气成分，包括苯乙醇、乙酸乙酯、棕榈酸乙酯、2-甲基丁酸、苯乙醛、月桂酸乙酯等，具有应用于食醋发酵并提高食醋品质的潜能。本研究在此基础上，以高粱为原料进行固态发酵，通过单因素及Plackett-Burman试验筛选主要影响因子，并采用Box-Benhnken设计建立数学模型进行响应面试验，探究白地霉M5产酯发酵的最佳工艺条件，以期为其应用于食醋等传统食品的酿造奠定基础。

1 材料与设备

1.1 材料

菌株M5：分离自新鲜酒醅。

培养基：YEPD培养基、MEA培养基[12]。

固态发酵培养基：原料100 g粉碎后灭菌，加入适量糖化酶制备成固态发酵培养基。

试剂：氢氧化钠、硫酸、乙酸、乙醇等，以上试剂均为AR级。

1.2 仪器与设备

25 mL碱式滴定管；25 mL酸式滴定管；250 mL锥形瓶；移液管；全玻璃回流装置；ST3100实验室pH计 奥豪斯仪器有限公司；B11-3恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；DL-1万用电炉 北京市永光明医疗仪器有限公司；JJ124BC型电子天平 常熟市双杰测试仪器厂；HHS型电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司。

2 方法

2.1 产酯能力的测定

采用改进的电位滴定法。

2.2 总酯的测定

采用皂化回流法，参照GB/T 13662-2008[13]。

2.3 单因素试验

以总酯含量为测定指标，研究摇床转速、接种菌龄、发酵时间、培养温度、接种量等因素对白地霉M5固态发酵产酯的影响。

2.3.1 接种菌龄对总酯含量影响的测定

将摇床转速120 r/min活化后的白地霉M5以9.0%(V/m)的接种量接入高粱固态培养基中，在菌龄分别为12，24，36，48，60 h，28 ℃条件下培养7天，测定其总酯含量，探究接种菌龄对白地霉M5产酯含量的影响。

2.3.2 摇床转速对总酯含量影响的测定

将活化后菌龄为24 h的白地霉M5以9.0%(V/m)接种量接入高粱固态培养基中，28 ℃条件下培养7天，菌液摇床转速分别为90，120，150，180 r/min，测定其总酯含量，探究摇床转速对白地霉M5产酯含量的影响。

2.3.3 发酵时间对总酯含量影响的测定

将活化后菌龄为24 h、摇床转速为120 r/min的白地霉M5以9.0%(V/m)的接种量接种于固态发酵培养基中，在28 ℃条件下培养3，5，7，9，11天，测定其总酯含量，探究发酵时间对白地霉M5产酯含量的影响。

2.3.4 培养温度对总酯含量影响的测定

将活化后菌龄为24 h、摇床转速的120 r/min的白地霉M5以9.0%(V/m)的接种量接种于固态发酵培养基中，分别在25，28，31，34，37 ℃条件下培养7天，测定其总酯含量，探究培养温度对白地霉M5产酯含量的影响。

2.3.5 接种量对总酯含量影响的测定

将活化后菌龄为24 h、摇床转速为120 r/min的白地霉M5分别以接种量为5%，7%，9%，11%，13% (V/m)接入高粱固态培养基中，28 ℃条件下培养7天，测定其总酯含量，探究接种量对白地霉M5产酯含量的影响。

2.4 Plackett-Burman(PB)法筛选试验

根据试验设计的要求，在单因素试验的基础上对影响白地霉M5总酯产量的5个主要研究因素接种菌龄、摇床转速、发酵时间、培养温度、接种量等进行PB试验，见表1。

表1 因子筛选试验因素水平表

2.5 白地霉M5产酯发酵条件的响应面优化

根据Plackett-Burman试验确定发酵条件各因素的影响顺序，选取前3个显著因子(接种菌龄、摇床转速、接种量)为主要影响因素，以总酯含量为响应值设计3因素3水平的响应面试验(见表2)，得出其最优发酵工艺条件。

表2 响应面分析的因素水平

3 结果与分析

3.1 白地霉M5的产酯化能力

表3 不同培养基的酯化酶活力比较

由表3可知，白地霉M5在不同培养基中的产酯能力有明显差异。相较于麸皮固态培养基，在高粱固态培养基上产酯能力更加显著，100 mL样品中乙酸乙酯浓度高达323.84 mol/L，说明该菌株的产酯能力极强。且与其他菌株相比较[14]，白地霉M5的产酯能力较高。

3.2 单因素试验

3.2.1 接种菌龄对总酯含量的影响

图1 接种菌龄对总酯含量的影响

由图1可知，随着接种菌龄的增加，总酯含量呈现先缓慢增加后逐渐减少的趋势。当接种菌龄达到24 h时，总酯含量达到最大值，为3.22 g/dL；当接种菌龄大于24 h时，总酯含量缓慢降低，酯类物质慢慢减少。由于白地霉M5菌龄在24 h达到对数期，可能导致24 h后随着菌龄的增加，菌株M5的产酯能力变弱。故白地霉M5产酯发酵的最佳接种菌龄为24 h。

3.2.2 摇床转速对总酯含量的影响

与静置发酵相比较，不同摇床转速的发酵会增加菌株生长繁殖的能力[15]。

图2 摇床转速对总酯含量的影响

由图2可知，随着摇床转速的增加，白地霉M5的总酯含量明显呈先上升后下降的趋势。当摇床转速达到150 r/min时，总酯含量达到最大值，为3.19 g/dL；当摇床转速大于150 r/min时，产酯量下降，其原因可能是振荡过快、通气量太大使酵母呼吸旺盛，从而加速了酯的分解，使得该菌株的产酯能力随之下降[16]。由此可知，菌株M5产酯发酵的过程需要一定量的空气，不宜过多。因此，白地霉M5产酯发酵的最佳摇床转速为150 r/min。

3.2.3 发酵时间对总酯含量的影响

图3 发酵时间对总酯含量的影响

由图3可知，随着发酵时间的增加，总酯含量呈缓慢上升后大幅度下降的趋势。当发酵时间为7天时，总酯含量达到最大值，为3.22 g/dL；当发酵时间大于7天时，该菌株的总酯含量下降，造成以上现象的原因可能是发酵时间过长导致培养基中营养物质被消耗，发酵过程中的风味发生变化，甚至出现酸败现象[17]。因此，白地霉M5产酯的最佳发酵时间为7天。

3.2.4 接种量对总酯含量的影响

图4 接种量对总酯含量的影响

由图4可知，随着接种量的提高，白地霉M5的总酯含量明显呈先上升后下降的趋势。当接种量达到11%(V/m)时，总酯含量达到最大值,为3.28 g/dL；当接种量高于11%(V/m)时，该菌株的产酯量呈下降趋势，可能是由于接种量过高，导致固态培养基在发酵中营养物质过快得消耗，较多的代谢产物和次代谢产物抑制了菌株的生长和产酯的能力。故白地霉M5产酯发酵的最佳接种量为11%(V/m)。

3.2.5 培养温度对总酯含量的影响

图5 培养温度对总酯含量的影响

由图5可知，不同的培养温度对白地霉M5的总酯含量有不同影响。培养温度在25～34 ℃时，总酯含量变化不大；当培养温度为28 ℃时，总酯含量达到最大值，为3.26 g/dL；而培养温度高于34 ℃后，该菌株的产酯量呈大幅度下降趋势，可能是由于温度过高抑制了菌株的生长和产酯能力。故白地霉M5产酯发酵的最佳培养温度为28 ℃。

3.3 PB试验

在单因素试验的基础上，利用因子筛选试验进行显著因子的筛选，采取分组为12组，水平为2的试验设计，对接种菌龄(A)、摇床转速(B)、发酵时间(C)、接种量(D)、培养温度(E)5个因素进行考察，试验设计与结果见表4。

表4 Plackett-Burman试验设计与结果

根据试验数据，拟合得到的方程：总酯含量=3.09933+0.03033A-0.04650B+0.00950C-0.05083D+0.01800E。通过Minitab17软件进行方差分析可知，在研究的整体回归区域内，该模型的拟合性比较好，判定系数为R2=0.9241，说明影响总酯含量的主要因素筛选试验中，92.41%的数据可由该模型解释说明，试验结果准确。

表5 Plackett-Burman试验方差分析

根据试验结果的方差分析，由表5可知，3个因素P(A)=0.016、P(B)=0.002、P(D)=0.001其P值均小于0.05。因此，选择接种菌龄、摇床转速和接种量进行响应面试验。

3.4 响应面法试验结果

3.4.1 响应面法试验结果及方差分析

响应面试验设计是通过因子筛选的结果进行进一步的设计方案优化，根据3.2的筛选结果得出3个显著因子，即接种菌龄(A)、摇床转速(B)、接种量(C)，见表6。

表6 响应面试验设计与结果

应用Design Expert 8.0.6.1软件设计的响应面试验结果进行多元化回归拟合分析，得出菌株M5固态发酵的总酯含量(Y)与接种菌龄(A)、摇床转速(B)、接种量(C)3个因素变量的二次方程模型为：

Y=3.13+0.012A-8.487E-003B+0.012C-6.500E-004AB+2.750E-004AC-0.011BC-0.062A2-0.091B2-0.041C2。

表7 响应面试验设计与结果

续 表

注：“**”表示极显著(P<0.01)，“*”表示显著(0.01

由表7可知，模型的失拟项P=0.0757>0.05，结果不显著，表明回归方程不失拟，可反映3个因素与响应值间的真实关系；回归模型P<0.0001<0.01，说明模型极显著，表明试验设计的可靠性；模型的回归决定系数R2=0.9916，表明响应值的变化有99.16%来源于所选因素的变化，且该模型能够较好地拟合试验结果；预测Pred-R2=0.8908也能合理地说明校正决定系数Radj2=0.9809值的变化。另外，A和C对Y影响极显著，B对Y影响显著，且A和C均为正效应，二次项AB和BC对Y均为负效应，说明影响菌株M5固态发酵产总酯含量3个因素之间对发酵工艺没有明显的交互作用；A2，B2和C2对Y影响极显著，这说明接种菌龄、摇床转速和接种量3个因素都是在发酵产酯过程中需要主要控制的因素。综上所述，各因素对总酯含量的影响不是简单点线性关系。

应用Design Expert 8.0.6.1的Optimization对菌株M5固态发酵的产酯条件优化，其结果与微分法所得结果一致，且仅有一种优化方案，模型拟合合理。得知的3个自变量最优真实值为：接种菌龄24 h、摇床转速150 r/min和接种量11%，其预测的总酯含量可达到3.1301 g/dL。

3.4.2 白地霉M5产酯发酵条件的响应面分析及等高线

响应面图形分析可以直观地反映出各因素和它们之间的交互作用对响应值的影响，利用Design Expert 8.0.6.1软件进行二次多元回归拟合，所得的二次回归方程的响应面图及等高线见图6～图8。

图6 接种菌龄与摇床转速交互作用的响应面图和等高线图

图7 接种菌龄与接种量交互作用的响应面图和等高线图

图8 摇床转速与接种量交互作用的响应面图和等高线图

根据各因素之间两两相互作用的响应面图形观察，各因素间的交互作用较为强烈，由此可知曲线走势越险抖，其影响越显著；曲线走势越平缓，其影响越小。曲面的形式变化反映响应值的变化大小。由图6～图8可知，A，B，C 3个响应因素在选定范围内都存在极值即响应面顶点，其中BC交互作用是较显著的，AB、AC交互作用不显著。

3.5 响应面验证性试验

利用Design Expert 8.0.6.1软件进行响应面试验，通过优化得出：接种菌龄为24 h、摇床转速为150 r/min、接种量为11%(V/m)，得到的最佳总酯含量3.1301 g/dL。为验证上述结果的可靠性，在此最优条件下对菌株M5进行固态发酵，做3次平行试验，得到的实际平均值总酯含量：(3.1301±0.0047) g/dL，与Box-Behnken模型具有较高一致性，故得到的模型能够较好预测白地霉M5固态发酵产酯条件及总酯含量，具有可靠的现实意义。

4 结论

在单因素试验的基础上对影响白地霉M5固态发酵产酯因素进行PB试验，经过筛选得到3个显著因子，分别为接种菌龄(P=0.0063<0.01)、摇床转速(P=0.0327<0.05)、接种量(P=0.0072<0.01)。根据PB试验筛选出的3个因素进行响应面试验，最终得到发酵最佳工艺为：接种菌龄为24 h、摇床转速为150 r/min、发酵时间7天、接种量为11%(V/m)、培养温度28 ℃，总酯含量为3.1301 g/dL，比原总酯含量提高了56%。综上所述，白地霉M5具有高产酯能力，为后期应用于食醋的酿造、提高食醋的品质奠定了基础。