对标准《疟原虫检测 血涂片镜检法》的几点思考

孙晓东 吕全 赵晓涛 许时燕 林祖锐 周耀武 段凯霞 丁春丽 陈柒言 田鹏

血涂片镜检法检出疟原虫是确诊疟疾的最直接证据，该法具有成本效益高和可鉴别虫种等优点[1]，是疟疾病原学诊断最常用的方法之一，也是我国消除疟疾行动计划（2010-2020年）疟疾诊断首选方法[2]。世界卫生组织（WHO）建议已消除或正在消除疟疾的国家应维持有质量保证的疟疾诊断能力[3]，《疟原虫检测 血涂片镜检法》（WS/T 569—2017）行业标准的颁布与实施，为我国消除疟疾血涂片镜检提供了统一的操作流程和技术规范[4]，保障了显微镜镜检质量。虽然学者王善青对标准进行了详尽的解读[4]，但通过比对WHO推荐方法[5-6]和云南现场实际应用，几个核心问题值得商榷。

1 血涂片的制作

1.1 取血方法

我国标准规定用“已消毒推片”从刺血部位刮取血样再涂制于载玻片，而WHO推荐方法是用载玻片从刺血部位蘸取血样再用推片涂制。两种方法的流程刚好相反，但根据我国《医疗机构消毒技术规范》（WS/T 367—2012），上述取血的推片和载玻片都因接触破损皮肤均属高度危险性物品，两者都应进行高水平消毒或灭菌处理[7]。我国标准明确规定用“已消毒推片”，而WHO推荐方法对载玻片的准备只是清洁和分包保存，未“消毒”处理，这显得我国标准略为严谨。问题是在我国消除疟疾行动计划中，开展血涂片镜检的项目活动有两项，一项是被动病例侦查，即病例到医疗机构就诊由化验室（实验室）开展的镜检，尤其是疟疾流行区的哨点医院承担着门诊发热病例数1%～10%的监测任务[8]，仅云南一年的血检总数不少于30万人次；另一项是主动病例侦查，即疾控机构到现场进行人群筛查（调查）开展的镜检，尤其是本地感染病例疫点处置中的主动病例侦查需对疫点全民进行血检筛查。这两项活动如果根据我国标准则需准备足够的甚至成百上千数的“已消毒推片”。虽然我国标准未对“推片”进行详细的规定，但使用“边缘光滑的载玻片”[9]作为推片是每次疟原虫镜检培训的内容之一，云南也多次省级采购边缘抛光的双凹载玻片作为专用推片分发全省，其采购价远高于普通载玻片，无法像刺血针一样成为一次性用品，这就要求推片必须重复使用。在现场工作中，为防止肝炎、艾滋病等血液传染病的传播，已使用过的被血液污染的推片经酒精简单消毒再刮取下一位病例血液是严格禁止的，如果按照我国标准，这些推片则需进行严格的清洗清洁和高水平消毒灭菌，这是费时费力又复杂繁琐的一个工作。WHO规定用“边缘抛光的载玻片”作为推片涂制科学研究中的血涂片[6]，而在临床诊断中推片属可选设备[5，10]，一般用另一张载玻片的一角和短边侧缘涂制血膜，虽然涂制的薄血膜舌型边缘可能会有“毛刺”，但其载面未受到血液污染，这张载玻片又可蘸取下一病例的血样。因此，WHO推荐的取血方法虽“未消毒”可能存在一定风险，但基本避免了血液污染物接触破损皮肤，也免除了“已消毒推片”的投入和制备步骤。

我国标准规定“用拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片左下角刮取血液4～5 μl用于制作厚血膜，再用该端中部刮取血液1～1.5 μl用于制作薄血膜”。根据上述，推片即是边缘光滑（抛光）的载玻片，而载玻片大小一般为76 mm×26 mm长方形玻璃片，我国标准即是用拇指和食指捏住推片的长边（76 mm）中部，用左侧短边（26 mm）下角先刮取厚血膜血样，再用左侧短边的中部刮取薄血膜血样。虽然用推片一次性刮取厚薄血膜血样在涂制时可在载玻片上精确确定血膜的位置，方便厚薄血膜在载玻片上的整体布局，但可能出现以下问题：一是将推片左下角的血样涂于载玻片制作厚血膜时，由于血样在推片左下角过于朝上或偏向薄血膜血样，推片不得不尽可能平倒或平放以便血样能涂于载玻片，因厚薄血膜血样在推片左侧短边的同一面且间距极小（≤13 mm），这样也可能误把薄血膜血样沾于载玻片的错误位置。二是我国标准规定厚血膜涂制完成后“用干棉球抹净推片左下角上的血渍”，因薄血膜血样距左下角极近（≤13 mm），擦拭左下角极有可能把薄血膜血样也擦掉。三是用推片刮取血样，有可能把酒精消毒时未擦净的油渍或皮屑等刮下来而影响血膜质量。四是我国标准明确规定了厚薄血膜的血量，但缺乏生动形象的参照，刮取时只能通过挤压刺血部位控制出血量大概的估算刮取的血量和刮取次数，需要一定的经验积累，刮取后至血膜涂制前，无任何调整或修正的余地。WHO推荐方法是在载玻片的中央先蘸取一小滴血用于制作薄血膜，在离薄血膜血滴1 cm处蘸取2～3大滴血用于制作厚血膜，其用直径大概3 mm的小红点图示薄血膜血量，可通过挤压刺血部位控制出血量来确定蘸取血量和次数，在蘸取过程中，也可透过载玻片来观察蘸取血样情况决定蘸取的轻重，蘸取血样后，尚可用推片的一角快速调整或修正厚薄血膜的血量（如薄血膜血量过少或过多，可从厚血膜血滴中余出或余进）。WHO推荐针刺后的第一滴血应擦除，这样可通过第一滴血的出血情况预判第二滴出血量和挤压力度，但挤出的第二滴血处于圆整状态，蘸取的薄血膜血量往往过多。也因其先蘸取薄血膜血滴，在制作薄血膜时中间隔了厚血膜取血过程，如果涂片者行动稍慢和天气干热，薄血膜血滴容易干燥而影响薄血膜质量。同时，厚薄血膜之间的预留的位置过宽，虽然可通过引导厚血膜的圆心方向来调整厚薄血膜之间的距离，但其2～3滴布局导致其引导力度有限。因此，WHO推荐方法对厚薄血膜在载玻片上的整体布局稍显随意，但其对厚薄血膜血量的可控性好，涂制过程中不需擦拭清洁推片。

1.2 血膜制作

我国标准未对厚薄血膜的制作进行详细的规定，仅是“由里向外划圈涂成直径0.8～1.0 cm的圆形厚血膜”和“使2张玻片保持25°～35°，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜”简单的结果性描述。因我国标准规定用推片的短边同时刮取厚薄血膜血样，这样厚薄血膜制作顺序只能是先厚再薄，也只能用推片的短边来制作薄血膜（本文用推片的短边制作薄血膜的手法称为竖推法，用推片的长边来制作薄血膜的手法则称为横推法）。WHO推荐方法是把蘸取血样的载玻片放在一个稳固平台上来涂制厚薄血膜，顺序是先薄再厚，手法也只能是竖推法。然而在平台上制作血膜，虽然能更好的使血样在推片与载玻片接触面水平扩散和保持厚血膜厚度均匀，但平台的高矮和水平程度将影响血膜制作，特别是基层现场工作，涂制血膜的平台将是必备品。而且在平台上涂制薄血膜时，捏持推片的手臂因为重力无形中产生一种向下的力量，制出薄血膜往往太薄，也无法保持推片前推的方向，对于血液过于黏稠而不沿接触面扩散的处置能力差。同时，WHO推荐把推片的短边压在薄血膜血滴之上，等血液沿接触面扩散后再前推，这样压在血滴上面，推片后面的血有时候未完全扩散会留下一部分形成一个小血斑，即减少了制作薄血膜的血量，涂制血膜有时会存在“拖尾”现象。临床血液一般检验是血液学检验最基础的一类检验项目，血涂片制备是检验人员必备技能之一，而薄血膜的厚薄长短与血滴的大小、推片的角度、推片速度及血细胞比容有关，一般认为血滴大、角度大、速度快则血膜越厚，反之越薄[11]。在云南实际工作中，竖推法和横推法两种推片手法均同时存在，这取决于个人习惯和受训情况，其中中老年人群多用横推法，青年人群多用竖推法，但两种推片手法孰优孰劣未见相关报道。

1.3 厚血膜厚度

我国标准规定厚血膜厚度“以1个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜”，而WHO推荐是平均每个油镜视野10～15个白细胞为佳[6]。尚不说两种方法确定的白细胞数有差异，关键是这两种方法都是染色后镜检的结果指标，对血膜制作过程中的厚血膜厚度的参考意义不大。我国和WHO曾用“透过血膜能刚好看见印刷的字迹”[10，12]作为厚血膜厚度的制作指标，方便涂片者掌控血膜厚度和大小。

1.4 现场应用

根据上述比对，理想的血涂片制作方法及步骤是：针刺取血部位后，右手手心朝下、拇指和食指捏住载玻片长边侧缘后1/3（手指勿碰载物面，如载玻片单侧磨砂，则磨砂端朝左和磨砂面朝下），在朝下的载物面中央偏左蘸取一个火柴头大小的血滴用于制作厚血膜，在中央偏右蘸取1/4火柴头大小血滴用于制作薄血膜，厚薄血膜血滴间距1 cm左右。翻转右手心朝上，用左手拇指和食指从右手下方捏住载玻片的短边侧缘（薄血膜血滴朝左手拇指），并保持载玻片水平。用右手拇指和食指捏住推片长边侧缘前端（距前角5 mm左右），将推片短边下缘平抵载玻片薄血膜血滴前5 mm（勿压在血滴上），拇指和食指捏住推片的同时轻抵载玻片长边侧缘形成滑槽（横推法仅是用握住推片的食指指背轻抵，其他相同），保持推片与载玻片25°～35°，推片先缓慢后退刮取全部血滴，观察血样沿推片与载玻片接触面扩散，距长边侧缘1～2 mm时推片后退变前推，快速从右至左直抵左手拇指，前推时，只有前推的力量，无下压的力量，中间勿停顿或抬起直抵左手拇指。用推片的下角向左或向右由里向外划圈涂成透过血膜能刚好看清印刷字体、直径0.8～1.0 cm的圆形厚血膜，厚薄血膜间距5～8 mm左右。事实上，这是云南目前普遍采用的方法和步骤（少部分用推片刮取血样），这即结合了我国标准与WHO推荐方法的优点，又克服了两种方法的不足，如用载玻片蘸取血样减免了“已消毒推片”的投入与制备，工作中只需准备3～5片专用推片，涂制后用酒精棉球擦拭干净晾干即可等等，该方法从取血样到涂制血涂片，中间无需摆放和清洁，特别是左手持载玻片右手持推片，姿势更协调，竖推法和横推法都可实现。

2 薄血膜固定

我国标准规定“用棉签蘸取甲醇溶液，均匀轻抹于薄血膜表面”的固定方法。由于薄血膜极薄和甲醇易挥发干燥，因商用的医用棉签的棉花是裹紧的，棉签与载玻片接触面积较小和吸取溶液量少，如果“轻抹”是轻点/轻按，用棉签固定则易产生遗漏，染出的薄血膜就有漏洞，如果“轻抹”是轻擦抹，则易损坏薄血膜，固定后的棉签上可见血样残留，油镜镜检薄血膜可能会有淡淡的薄雾感。WHO推荐方法是用甲醇浸湿的棉球轻点或把薄血膜浸入甲醇溶液的固定方法。棉球蓬松吸水性好，操作容易但会造成甲醇浪费，另一方法用无色广口瓶盛装甲醇溶液，厚血膜朝上的把薄血膜侵没于溶液中进行固定。此法如果甲醇溶液过少，需整张载玻片伸入广口瓶内才能侵没薄血膜，则瓶内高浓度的甲醇蒸汽可能会把厚血膜也固定，因此广口瓶的甲醇溶液需保持一定容量。在云南实际工作中，固定薄血膜最常用的方法用滴管吸取甲醇后，保持薄血膜和滴嘴均朝下的贴在一起，滴嘴略超出载玻片少许，轻捏吸头的同时滴管向下划过薄血膜进行固定，也有的保持载玻片厚血膜朝上的一定倾斜，把甲醇滴在薄血膜起始端，用滴管摊开或直接用甲醇溶液覆盖薄血膜进行固定，极少人用自制的蓬松加长棉签或用2～3根医用棉签蘸取甲醇染液后轻拖抹或轻点薄血膜固定。

3 吉氏染色

我国标准规定用3%和10%工作液染色临床检测的单张血片，用2%工作液染色现场调查的成批血片，虽然详细规定了3种浓度的配比，但配制前均需计算各液体的容积，尤其是染色单张或少量血片工作液的配制，定量移液器成为必备品。WHO推荐10%快染和3%慢染两种染色方式，其中10%快染用于急需结果的1～15张血片染色，其工作液配制是1 ml缓冲液加3滴染液原液，3%慢染是用3%工作液对20及以上调查研究及教学血片进行染色。我国标准的单张血片染色和WHO推荐的快染用途和染色方法一致，都是把血片水平摆在染色盘的横架上，都是吸取3 ml新配制的工作液覆盖血膜，但WHO工作液配制方法更为简便易行。问题是3 ml工作液是全覆盖载玻片，即浪费染液又极易导致外溢，尤其是拿起已染好血片冲洗时极易引起染液外溢而影响染色质量。我国标准的2%批量染色和WHO推荐的3%慢染用途和方法也一致，都是用染色缸（架）大批量染色，但此法消耗染液量极大，例如用10槽玻璃染缸背靠背的染色20张血片，需配制100 ml工作液使用染液原液2～3 ml。我国和WHO均详细规定了缓冲液的配制，但WHO推荐了一种简便方法，即用商品化“缓冲片”加入一定量的水，这有利于条件有限的基层机构维持染色质量。在云南实际工作中，一部分使用商品化的吉氏染液原液和配套缓冲液，一部分使用省级配发的双重过滤吉氏染液原液，用pH为7左右的瓶装水替代缓冲液。染色方法是1 ml水加3滴染液原液染色8～10分钟的快速染色和1 ml水加1滴染液原液染色30～45分钟的标准染色，工作液配制量是（N+1）ml（N为血片数），用吸管吸取新配制的工作液2 ml，从血膜上3～5 cm高度滴下，利用工作液自由落体覆盖全血膜，这样既节省昂贵的染液，又方便基层掌握操作。

4 结语

云南历史上属我国高疟区，发病率常年位居全国榜首，在云南抗击疟疾近70年的历程中，云南疟防工作者积累了丰富的符合云南实际的工作经验，本文仅从云南工作实际出发，因未掌握其他省份或其他更为先进的疟原虫显微镜检测技术，尚不能形成建议或意见，仅供学者商榷。