RIP1 与TNF-α 诱导信号通路关系的研究进展

李承宗

肿瘤坏死因子是一类具有诱导细胞凋亡功能的细胞因子，可由多种细胞分泌、表达，其生物学功能主要涉及细胞凋亡、诱导炎症应答、参与免疫调节等。TNF-α是肿瘤坏死因子家族最重要的细胞因子，主要通过上调MAPK、ERK、NF-κB等信号通路来诱导细胞凋亡及促炎症作用，发挥其生理学作用。越来越多的研究证实TNF-α可通过与它的重组人1型肿瘤坏死因子受体（Recombinant Human Tumor Necrosis Factor Receptor Type 1，TNFR1）结合后启动了下游的信号通路。RIP1是复合体I中的一种组成因子，在人体中能够控制包括炎症反应、细胞生存及死亡过程。RIP1目前已经成为临床医学控制人类炎症反应、治疗恶性肿瘤疾病的新靶点和热点话题。因此，本文根据RIP1与TNF-α诱导信号炎症通路的相关性进行综述，为探索RIP1及TNF-α诱导信号通路关系治疗人类恶性肿瘤疾病提供参考策略。

1 RIP1 结构和复合体相关概述

1.1 RIP复合体家族构成

RIP复合体家族是具有特异性的N末端丝氨酸（serine）、N末端苏氨酸（threonine） 的一系列激酶活性蛋白。目前临床上发现RIP家族共7个成员，分别为RIP1-RIP7[1-2]。RIP1-RIP7的N末端结构具有高度同源性，激酶结构域具有相似性，另外提示RIP1-RIP7蛋白家族成员可能具有某种相同或者相似的生物学功能。而RIP1-RIP7家族的中间结构、C端结构之间存在一定的差异，研究发现RIP复合体家族中的RIP1里的C端结构含有一个死亡结构域（DD，death domain），但是中间结构则包含一个RIP同型结构域（RHIM，a RIP homotypic interaction motif）和一个与相互连接的中间域（ID，a bridging intermediate domain）；RIP复合体家族中的RIP2里的C端结构则含有一个caspase募集域（CARD，caspase recruitment domain），但是其中间结构仅包含有一个ID；另外RIP3比较特别，RIP3的C端结构是RHIM且缺少中间结构域；RIP4和RIP5的C端结构都是锚蛋白域（ankyrin domains，AD），但是其中间结构则是ID；最后的RIP家族成员RIP6和RIP7的结构与其它RIP家族成员相关性较弱，目前国内外关于RIP4-7的功能的相关研究甚少[3]。笔者认为了解RIP家族各成员尤其是RIP1结构的具体了解能够帮助临床学者更好地探讨RIP家族的生物学功能。

1.2 RIP1的分子结构分析

RIP1中间域上有一种物质为赖氨酸377（Lysine 377，Lys377），Lys377同时也是泛素分子Lys63介导的一个重要的泛素化RIP1位点，通过对RIP1位点发生泛素化影响后Lys377可以与其他泛素受体蛋白相结合并形成复合体，此时RIP1能够与非依赖k基因结合核因（Nuclear Factor-k-gene Binding，NF-κB）发生转录，并通过这种方式调节人体细胞的生存状态[4]，但是目前尚未有临床研究对RIP1其他位点泛素化情况进行统一、明确的定义及分析。RIP1上的RHIM具有调节其他含有RHIM蛋白或相关因子的家族成员如RIP3进行相互作用的功能，RIP1在这一过程中能够与RIP3中的RHIM相互作用并形成一个丝状淀粉样结构，且这一结构对调节人体中的坏死性凋亡（necroptosis）机制具有决定性作用。

RIP1成员中的C末端DD是6螺旋折叠的结构状态，而这种6螺旋折叠结构在TNF-受体相关死亡结构域蛋白（TNF receptor-1-associated death domain protein，TRADD）和FAS相关的死亡结构域蛋白（FADD，FAS-associated death domain protein）中同样存在，另外RIP1成员的DD能够参与如细胞膜上与死亡配体刺激下产生受体复合物的结合的细胞同质蛋白的相互作用以及在细胞内形成复合物如与FADD的死亡结构域的结合引起凋亡（apoptosis）并起到调节下游信号的作用等[5]。

1.3 RIP1 成员的生物学功能分析

国内外关于RIP1功能的临床研究中发现RIP成员能够引起细胞凋亡，其机制可能是RIP1成员里的中间结构域RHIM与RIP3成员相互作用并形成功能性淀粉样信号复合物（functional amyloid signaling complex），而这种信号复合物能够诱导细胞发生程序性凋亡。RIP1成员对细胞的生存和死亡起决定作用，是信号通路下游死亡受体信号的中央控制器。陈瑶等[6]在一项敲除RIP1基因的小鼠相关研究中发现，敲除RIP1基因的小鼠仍然可以正常地出生并生长，但是当小鼠出生后会出现脂肪组织细胞和淋巴细胞的广泛死亡，最终敲除RIP1基因的小鼠在3天之内全部死亡；另外Schneider等人[7]在研究中利用re-loxP 基因重组技术在敲除RIP1基因小鼠的研究中发现单独敲除肠上皮细胞或者肝细胞的RIP1基因表达小鼠对小鼠的发育并没有发现较为明显的影响，提示RIP1基因可能是机体免疫淋巴系统存活和发育的关键性因子，作用重要。Luan等人[8]在研究中报道了成纤维细胞敲除RIP1基因后比成纤维细胞没有敲除RIP基因对于TNF-α诱导的凋亡机制敏感性更高，另外在Jurkat细胞敲除RIP1基因后也观察到相似的现象和情况，提示RIP1基因可能是TNF-α诱导的促生存、抗凋亡和炎症反应发生信号通路上的重要因子。

2 RIP 基因与TNF-α 诱导的促细胞生存、炎症反应的信号通路关系

2.1 RIP1基因参与构成、维持复体物I的过程

TRADD，RIP1，TRAF2，and cIAP1/2在促生存、抗凋亡和炎症反应发生信号通路的TNF-α信号诱导下与胞内段的TNFR1构成复体物Ⅰ相结合并形成复合物，而RIP1基因是复合物Ⅰ的重要组成因子，另外研究发现复合物Ⅰ的主要功能是激活MAPKs/AP-1信号通路和NF-κB信号通路并促进人体细胞的生存以及导致炎症反应的发生。

2.2 RIP1基因参与调控TNF-α诱导的NF-κB信号通路过程

NF-κB活化过程已经被多项临床研究证明与人体的多种侵袭性恶性肿瘤的发生和发展具有密切相关性，另外在TNF-α诱导的包括NF-κB等众多激活物中可能是最快速、有效的激活因子[9]。RIP1基因通过与连接在K377的位点上的K63泛素链相互链接能够与TAK1（transforming growth factor（TGF）-β-activated kinase 1）信号通路、TAB2/3 （TAK1-binding proteins 2 and 3）信号通路相结合，结合后TAK1信号通路和TAB2/3信号通路能够激活由调节亚单位IKKγ和两个催化亚单位 IKKα和 IKKβ 组成的IKK复合物，而这个过程会引起细胞胞质中的NF-κB三聚物中的IκBα发生磷酸化反应，另外发生磷酸化反应后的IκBα被K48相互连接泛素化链进行修饰，最终使蛋白质发生降解。游离的NF-κB迅速移位到细胞核后与失去IκBα的暴露核定位位点 NF-κB分离，同时与特异性κB序列进行结合，进一步诱导细胞中的促生存信号的基因发生转录行为，提示泛素化RIP1基因在激活NF-κB信号通路中具有重要作用。相关临床研究对存在RIP基因缺陷的Jurkat细胞、恶性黑色瘤细胞、肝癌细胞进行报道并发现，TNF-α不能诱导并激活NF-κB 信号通路，但是TNF-α在FAS诱导的细胞凋亡调节机制中没有相应的作用，提示RIP1基因是TNF-α可能是激活NF-κ信号通路中的关键因子[10-11]。但是相关临床学者在研究中认为RIP1基因在TNF-α激活NF-κB信号通路中不是必需的，不管是药物抑制或者突变失活均会使RIP1基因失去活性，因此在TNF-α诱导下的NF-κB信号通路中活化作用没有起到任何的作用。Filliol等人报道了小鼠成纤维细胞和肝细胞中的TNF-α激活NF-κB的反应中没有发现RIP1基因的参与[12]，提示RIP1基因对TNF-α激活的NF-κB信号通路的调控作用可能存在不同组织类型、细胞之间的差异，但是目前尚未有明确的结论分析相关机制，需要进一步研究。

3 RIP1 基因抑制TNF-α 诱导Caspase-8 介导的凋亡信号通路相关性

TNF-α介导的细胞凋亡过程需要Caspase-8进行活化发挥作用，同时TNF-α也是外源性凋亡机制发挥作用的重要因子。TNF-α在TNFR1信号通路中除了通过复合体Ⅰ急性激活并起到促生存、炎症反应的作用外，TNF-α还可以通过TRADD与RIP1基因、FADD、Caspase-8形成复合体Ⅱa，而复合体Ⅱa一般以酶原的状态存在于无活性的Caspase-8中，进一步聚集后迅速活化并触动信号通路下游的其他Caspase因子最终发动联级反应，通过这一过程启动细胞凋亡的开始。刘诚林[13]报道了肠上皮细胞单独敲除RIP1基因小鼠且结果发现肠上皮细胞同时发生了TNF-α诱导、Caspase-8介导的细胞凋亡过程，提示RIP1基因在抑制TNF-α诱导、Caspase-8介导的细胞凋亡过程种占据重要地位。RIP1基因同时具有抑制凋亡进而加速凋亡的作用，表明RIP1基因可能通过不同状态参与人体中的不同信号通路的调控过程。相关研究发现，当RIP1基因中的Lys377Arg泛素化的重要位点被突变后，RIP1基因能够从抑制凋亡的信号通路转变为参与TNF-α诱导、Caspase-8介导的细胞凋亡信号通路，提示泛素化RIP1基因在TNF-α促生存、抗细胞凋亡、炎症反应信号通路中起重要作用。

4 泛素化状态对RIP1 基因的调控过程

研究中发现在TNF-α信号通路下对RIP1基因进行5分钟的诱导后发现RIP1基因迅速聚集到complex I中，此时发现RIP1基因的泛素化受到抑制，同时也进一步抑制了NF-κB的活性[14]，提示TNF-α对RIP1基因泛素化起到决定性作用。一项临床研究中对TRAF2、TRAF5基因缺陷的大鼠进行分析后发现RIP1基因的泛素化状态会受到严重抑制，另外TRAF2基因可以增加K63对RIP1基因的泛素化链接程度，而cIAP1基因和cIAP2基因则对RIP1基因泛素化调节没有起到任何的作用[15]。

RIP1基因能够通过8个类型的泛素化链来实现泛素化，这8个类型分别是Lys6，Lys11，Lys33，Lys48，Lys27，Lys29， Lys63 、Met1[16]。另外在TNF-α诱导下Lys377是RIP1基因泛素化的唯一结合位点；研究中对Lys48引导泛素化链对RIP1泛素化作用进行分析发现，Lys48能够引起RIP1基因蛋白酶体降解导致调节功能显著下调[17-18]；Lys63引导的泛素化链对RIP1基因的泛素化作用比较特别，它能够上调RIP1基因调控的信号程度，而Lys48则会降低RIP1基因调控的信号程度。

此外，LUBAC是RIP1基因泛素化链形成的重要组成部分，信号通路下游的复合物包括NEMO会与IKKα以及IKKβ进行结合，同时激活细胞中IKKβ的活性，并对NF-κB的活性起到调节作用；临床学者研究发现K63引导的RIP1基因泛素化在TNFα信号诱导的NF-κB信号通路中没有发现必要的作用。

5 RIP1 基因参与TNF-α 诱导恶性肿瘤的相关性

RIP1基因可能促进恶性肿瘤疾病的发生和发展，由于RIP1基因蛋白在胶质母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、胆囊癌中呈现高表达，推测与患者的预后存在密切的相关性[19]。有临床学者进行了相关报道，RIP1基因蛋白在肝癌患者组织细胞中呈低表达，而RIP1基因高表达可能意味着肝癌患者预后更好[20]，提示RIP1基因在恶性肿瘤组织中可能存在着一定的特异性。RIP1基因能够通过激活 NF-κB信号通路调节mdm2 并抑制 P53，P53在促进机体恶性胶质瘤发展中起到重要作用，提示RIP1基因激活 NF-κB信号通路后的持续活化是导致恶性肿瘤细胞生长的重要因素。

临床研究普遍认为TNF-α在促进恶性肿瘤疾病的发生和发展中起着决定性作用，随着我国基因重组技术的发展为探讨RIP1基因在TNF-α信号通路中的作用提供了研究依据，但是恶性肿瘤的发生和发展是一个复杂、动态变化的过程，因此需要进一步收集大量的样本数据分析 RIP1基因在恶性肿瘤中的作用，而随着对RIP1基因在恶性肿瘤影响研究的深入分析，能够为人类恶性肿瘤疾病的治疗提供新的参考依据。