无创DNA产前检测技术筛查唐氏综合征应用效价分析

赵 兴

浙江大学明州医院(宁波，315100)

目前我国多数医院已开展了产前血清学筛查，即在孕中期采外周血检测血清甲胎蛋白(AFP)、游离β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)和游离雌三醇(uE3)，同时结合其他指标综合判断唐氏综合征(DS)患儿出生的风险率[2]。但影响结果的因素很多[3]。近年来，无创DNA产前检测技术得到推广应用，用DNA测序技术对母体外周血浆中的游离DNA片段测序，通过生物信息分析检测胎儿是否患21-三体综合征，其检测结果仅受母体外周血DNA背景的影响[4]。本研究通过比较两种检测方法的临床应用效价，客观评价无创DNA产前检测技术与传统血清学筛查，为提高临床检测水平提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性纳入2014年7月—2017年7月本院行产前检查的孕妇2217例，所有孕妇均在知情同意下参检，在孕中期行血清学筛查和无创DNA产前检测。孕妇年龄(27.7±4.7)岁(20～35岁)，吸烟47例，合并糖尿病56例。纳入标准：①预产期年龄≤35岁；②单胎妊娠；③产前检查时超声确认胎龄为15～20+6周。排除标准：①双胎、多胎妊娠；②接受体外受精—胚胎移植；③自身染色体异常；④两年内有异体输血史或移植手术史。

1.2 血清学筛查

所有孕妇于孕中期采集肘静脉血离心取上清液，使用时间分辨免疫荧光法检测血清AFP、β-hCG和uE3。仪器为Victor 1420免疫分析仪(芬兰Wallac公司)，试剂盒由北京奥维亚生物技术有限公司提供，严格遵守说明书进行相关操作。使用Multicalc软件，并结合孕妇基本信息(年龄、体重、吸烟史、糖尿病史等)计算风险切割值，以1/270为分界线，≥1/270判定为阳性，<1/270判定为阴性[5]。

1.3 无创DNA产前检测

所有孕妇于孕中期采集肘静脉血取上清液置入PE离心管中，所有标本用专用物流箱加干冰送至深圳华大基因公司进行检测。提取血浆中游离DNA，并在其末端添加接头，建立DNA文库。采用Illunfina HiSeq 2000测序平台，分析DNA片段的序列，检测染色体拷贝数，对比系统染色体序列计算样本中染色体拷贝数，分析有无染色体非整倍体异常。判断标准：若染色体拷贝数增多，且具有染色体非整倍体异常，则判为阳性；若拷贝数正常，则判为阴性[6]。

1.4 追踪随访及最终确诊

对血清学筛查和无创DNA产前检测阳性结果孕妇行羊膜腔穿刺，行细胞培养+染色体核型分析，确诊为阳性者建议终止妊娠，阴性者继续随访；对阴性结果孕妇，自筛查之日起定期产检复查B超，若B超提示死胎或发育异常建议引产，后行高通量测序最终确诊，活产的新生儿常规体格检查，随访至出生后42d。综合上述所有结果作为本研究的最终参照。

1.5 观察指标及统计学处理

评估血清学筛查与无创DNA产前检测的阳性检出率、假阳性率、阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度和假阴性率，阳性检出率=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%，假阳性率=假阳性/(真阳性+假阳性)×100%，阳性预测值=真阳性/(真阳性+假阳性)×100%，阴性预测值=真阴性/(真阴性+假阴性)×100%，灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%，特异度=真阴性/(真阴性+假阳性)×100%，假阴性率=假阴性/(真阴性+假阴性)×100%。

1.6 统计学方法

使用统计学软件SPSS 19.0进行数据统计。计数资料用率表示，各阳性率比较均采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同检测方法检出率与随访结果比较

2217例孕妇中，血清学筛查阳性41例(1.9%)，阴性2176例(98.1%)；无创DNA产前检测阳性19例(0.9%)，阴性2198例(99.1%)。随访结果，染色体非整倍体异常21例(0.9%)，正常胎儿2196例(99.1%)。血清学筛查阳性率高于随访结果(χ2=6.543，P=0.011)，无创DNA产前检测阳性率与随访结果无差异(χ2=0.101，P=0.751)。

2.2 血清学筛查对唐氏综合征筛查临床检出效价

将追踪随访结果作为最终参照，分析血清学筛查41例阳性结果的符合率以及2176例阴性结果的符合率。其中，真阳性17例，阳性检出率为81.0%；假阳性24例，假阳性率为58.5%。阳性预测率为41.5%，阴性预测率为99.8%，灵敏度为81.0%，特异度为98.9%；假阴性4例，假阴性率为0.2%。

2.3 无创DNA产前检测对唐氏综合征筛查临床检出效价

将追踪随访结果作为最终参照，分析无创DNA产前检测中19例阳性结果的符合率以及2196例阴性结果的符合率。其中，真阳性19例，阳性检出率为90.5%；假阳性0例，假阳性率为0，阳性预测率100.0%，阴性预测率99.9%，灵敏度为90.5%，特异度为100.0%。假阴性2例，假阴性率为0.1%。

3 讨论

临床DS检查(羊膜穿刺、绒毛取样等)以有创方法为主，孕中期血清学筛查与无创DNA产前检测均为无创检查，本研究血清学筛查的阳性率高于随访结果，而无创DNA产前检测阳性率与追踪随访结果相符，说明后者的准确性更高。

目前，绝大多数医院都开展了孕中期血清学筛查，通过对AFP、β-hCG和uE3检测判断DS患儿出生风险率。研究已知孕妇血清AFP下降与胎儿基因非整倍体异常相关[7]。孕妇血清β-hCG水平升高与DS有相关性[8]。孕妇血清uE3水平降低与DS胎儿肝脏、肾上腺发育不良有关[9]。采用三联标记方案(AFP+HCG+uE3)，DS检出率为67%[10]。本研究血清学筛查DS检出率(81.0%)较文献数据高，可能与样本例数较少有关。较多文献也报道血清学筛查假阳性率较高[11]，本研究的假阳性率与文献相符，可能与孕妇年龄、体重、孕周、吸烟史、糖尿病史等多方面因素干扰有关。由于较高的假阳性率，采用血清学筛查仍会迫使部分孕妇接受有创检查，加上DS检出率仅为60%～80%，部分非DS胎儿会被误流产。因此，临床上需要更为高效的产前检测手段。本研究孕中期血清学筛查中出现4例假阴性，假阴性率为0.2%。郑文吉[12]认为，造成孕中期血清学筛查假阴性最主要的原因是实验室质量控制不够，特别是中位数方程检测系统漂移，因此加强质量控制是关键。

孕妇血浆中游离胎儿DNA的特点有：①DNA片段的长度只有约150个碱基对；②妊娠早期即可出现在孕妇血浆中，半衰期短，分娩后1d即可从孕妇血浆中消失；③约占孕妇血浆中总DNA的20%[13]，因此被认为是用于产前筛查的理想胎儿物质。近年来，高通量测序技术得以应用，被提取的胎儿DNA片段可以被扩增和计数，无创DNA检测技术开始正式应用于临床。采用高通量测序技术中大规模平行测序技术检测胎儿DNA片段是否为非整倍体性，将DNA序列测序与正常人染色体基因组比较分析，可准确发现变异后的染色体[14]。因此，将这项技术用于DS筛查，实现了检测过程的无创性、快速性和高准确性。Benn对6339例高危孕妇的DS筛查中，最终确诊DS胎儿594例，而无创DNA检测技术检测590例，阳性检出率达到99.3%，假阳性率仅为0.16%[15]。比血清学筛查大大提高了阳性检出率。本研究中，采用无创DNA产前检测的阳性检出率低于上述文献报道，但高于血清学筛查，可能与本次样本量太少有关。任明保认为[16]，造成无创DNA检测假阴性最主要的原因可能是母血中提取的胎儿游离DNA量不够多，因此影响了最终的检测结果。本次无创DNA产前检测的阳性预测率、阴性预测率、灵敏度、特异度均优于血清学筛查。

综上所述，在DS胎儿的筛查中，无创产前DNA检测技术较血清学筛查的准确性和特异度更高，具有更高的阳性检出率，减少了侵入性产前检查和误引产的概率。