氟西汀对抑郁大鼠治疗的作用机制*

侯杰 沈忠飞 郭燕君 张小芬

(嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314000)

抑郁症临床表现为情绪消沉，兴趣减退，悲观绝望，思维迟缓和意志活动减退，多合并其它疾病，且易反复发作[1]。导致其社会功能、职业功能下降，给患者家庭、社会带来沉重的经济负担，所以抑郁症的治疗一直是全世界关注的重点。

虽然抑郁症的治疗方法很多，近几年抑郁症治疗的热点，主要是定向作用于海马神经元突触重塑[2]，而突触重塑与SYP和PSD-95的关系密切。研究表明，氟西汀治疗抑郁症时，突触重塑关键蛋白SYP和PSD-95有明显变化[3]，但其具体机制尚不明确。但抑郁症的发病机制尚不清楚。为了对抑郁症的发病机制有初步的认识，本实验采用慢性温和性不可预知应激刺激加孤养法建立大鼠抑郁模型[4]，在建立大鼠抑郁模型成功的基础上，对抑郁症大鼠进行氟西汀治疗，结果显示：经过28天CUMS干预后大鼠在体重、糖水消耗、旷场试验的活动次数比正常组明显减少，粪便颗数明显增多，中段停留时间和总路程明显少于正常组，表明大鼠兴趣丧失、快感缺失等，氟西汀治疗后这些症状均明显改变，表明已经成功造模。

然后再通过HE染色及蛋白印记实验和RT-PCR检测氟西汀治疗后大鼠海马突触可塑性关键蛋白SYP和PSD-95蛋白及mRNA的表达情况，以探讨氟西汀对抑郁发生的信号通路调控作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和药物

健康雄性SD大鼠30只，体重180～220 g，由浙江大学实验动物中心提供。盐酸氟西汀(Fluoxetine)分散片(美国礼来公司，中国苏州制药有限公司分装)。30只清洁级雄性健康 SD大鼠按体重随机分为3组，每组10只：正常组；模型组：CUMS刺激；氟西汀组：氟西汀10 mg·kg-1，1次/d，连续28 d，按体重给药灌胃；对照组和模型组给予生理盐水灌胃。

1.1.2 试剂与仪器

兔抗鼠SYP、PSD-95多克隆抗体(Proteintech，美国)；兔抗鼠β-actin、山羊抗兔二抗(北京中杉金桥)；总RNA小量制备试剂盒(杭州爱思进生物)；2× Easy TaqPCR SuperMix，TransScript TM Green Two Step qRT-PCR SuperMix，Trans DNA Marker I(北京全式金生物)；动物行为学检测和分析系统SuperMaze-XR-XM101(上海欣软信息科技)。

1.2 方法

1.2.1 CUMS大鼠模型建立

健康成年雄性清洁级SD，适应性单笼饲养7 d后，随机分为正常组和模型组，每组10只。正常组大鼠每天抓取一次，除外不做任何特殊处理。模型组给予慢性温和性不可预知性刺激，刺激包括9种：潮湿垫料24 h，行为限制2 h，禁食24 h，禁水24 h，4℃冰水强迫游泳5 min，昼夜颠倒24 h，噪声干扰12 h，悬尾30 min，足底电击5 s(30 v)。每日随机抽取一种不连续出现的同种刺激，使大鼠不能预料刺激的发生，持续28 d，建立大鼠抑郁模型。

1.2.2 行为学测定及动物取材

旷场实验(Open field test，OFT)和糖水消耗试验(Sucrose preference test，SPT)[5]的具体操作步骤如下。OFT：造模前1 d以及造模后第7、14、21、28 d分别置大鼠在旷场实验箱的中央格，观察5 min内的活动情况。观察指标：爬行总穿格数、中央格停留时间、粪便颗数和直立次数等。其中爬行总穿格数反映大鼠肢体活动性，中央格停留时间及粪便颗数反映大鼠的焦虑水平，直立次数反应大鼠的探索能力。SPT：试验前，在隔噪音、安静的房间内，训练动物适应含糖饮水，每笼同时放置2个水瓶，第一个24 h，两瓶均装有1%蔗糖水，随后的24 h，一个瓶装1%蔗糖水，一个瓶装纯水。23 h的禁食禁水后，进行动物的基础糖水/纯水消耗试验，同时给予每只大鼠事先定量好的两瓶水：一瓶1%蔗糖水，一瓶纯水。60 min后，取走两瓶并称重。计算动物的总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗、糖水偏爱(糖水偏爱=糖水消耗/总液体消耗×100%)。大鼠麻醉断头，冰上取脑分离海马，液氮保存后于-80℃冰箱保存，用于后续实验。

1.2.3 组织学检测

取海马组织，制作冰冻切片，HE染色观察海马神经元形态及数目改变。

1.2.4Western blot检测CUMS大鼠海马中SYP和PSD-95蛋白的表达水平

取大鼠新鲜海马组织，常规提取组织蛋白。配置SDS-PAGE凝胶浓度12%，蛋白样品处理上样电泳(先100 v，20 min；再180 v，40 min)，转膜(100 v，120 min)，5% 脱脂牛奶封闭1 h，孵一抗(SYP 1∶500、PSD-95 1∶500和β-actin抗体1∶1000，4℃过夜)，TBST洗一抗(5 min·次-1，3次)，孵二抗(羊抗兔，37℃，2 h)，TBST洗二抗(5 min·次-1，4次)，ECL试剂盒曝光显色。

1.2.5RT-PCR 检测CUMS大鼠海马中SYP和PSD-95mRNA的表达

取大鼠海马，按RNA提取试剂盒说明提取海马总RNA，按逆转录试剂盒逆转录成cDNA。据NCBI Genebank中大鼠基因序列设计引物如下表：

表3 PCR引物序列

PCR反应体系：模版1 μL，2xPCRmix 5 μL，上下游引物各0.5μL，双蒸水3 μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，PSD-95 65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，72℃延伸7 min ；95℃预变性5 min；95℃变性30 s，SYP 51℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，72℃延伸7 min ；95℃预变性5 min；95℃变性30 s，β-actin 50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，72℃延伸7 min，产物4℃保存。

1.2.5 统计学方法

2 结果

2.1 体重，旷场试验和糖水消耗的比较

与正常组比较，模型组大鼠体重、糖水消耗、旷场试验的活动次数比正常组明显减少，粪便颗数明显增多，中段停留时间和总路程明显少于正常组。与模型组相比，氟西汀组大鼠体重、糖水消耗、旷场试验的活动次数比正常组明显增加，粪便颗数明显减少，中段停留时间和总路程明显多于模型组(P<0.05)，见表1。与对照组比较，模型组所有时间点行为学评分升高(P<0.05)。与模型组比较，氟西汀组各时间点行为学评分降低(P<0.05)，见表2。

表1 氟西汀对CUMS大鼠体重、旷场试验和糖水消耗的影响

注：与正常组相比，△P<0.05；与模型组相比，○P<0.05。

表2 各时间点3组行为学评分比较(分，

注：与模型组相比，△P<0.05；与实验组相比，○P<0.01。

2.2 海马神经元形态、数目比较

正常组大鼠海马神经锥体细胞层数多且厚，神经元细胞排列整齐、紧密，结构清晰，染色均匀，核大而圆，胞浆内富含尼氏体，细胞间分界清楚(如图1A箭头所示)；模型组大鼠海马锥体细胞层变薄，胞体肿胀，核固缩，神经元排列紊乱、疏松，断裂明显，间隙扩大，胞浆尼氏体较对照组明显减少，甚至有大量神经元缺失、坏死(如图1B箭头所示)；氟西汀组大鼠海马锥体细胞形态、神经元缺失和胞浆尼氏体减少程度均相对较轻，与正常对照组大鼠海马锥体细胞无明显变化(如图1C箭头所示)。

图1 HE染色各组海马神经元形态、数目比较(×100)注： A正常组；B模型组；C氟西汀箭头所指为典型细胞。

2.3 Western blot检测CUMS大鼠海马中SYP和PSD-95蛋白表达水平

结果显示，CUMS大鼠海马中PSD-95蛋白表达比正常组大鼠显著增多(P<0.01)；氟西汀可明显降低海马中PSD-95蛋白的表达(P<0.01)。与正常组相比，模型组大鼠海马中SYP蛋白表达比正常组明显减低(P<0.01)；氟西汀组大鼠海马中SYP蛋白的表达显著升高(P<0.01)见图4。

图2 氟西汀对CUMS大鼠海马中SYP和PSD-95蛋白表达的影响注：1：正常组；2：实验组；3：氟西汀10 mg·kg-1。A-PSD-95代表性Western blotting图；B-PSD-95蛋白表达水平的统计结果；C-SYP代表性Western blotting图；D-SYP蛋白表达水平的统计结果。

2.4 RT-PCR检测CUMS大鼠海马中SYP和PSD-95 mRNA表达水平

与正常组相比，模型组大鼠海马PSD-95 mRNA表达显著升高(P<0.0l)；SYP mRNA表达较正常组显著降低(P<0.O1)；氟西汀作用后能够逆转CUMS大鼠海马中PSD-95和SYP mRNA的表达，见图3。

图3 氟西汀对CUMS大鼠海马中SYP和PSD-95 mRNA表达的影响注：1：正常组；2：实验组；3：氟西汀10 mg·kg-1。A-PSD-95 mRNA、SYP mRNA代表性RT-PCR图；B-PSD-95 mRNA表达水平的统计结果；C-SYP mRNA表达水平的统计结果。

3 讨论

抑郁症是全球范围内的常见疾病，WHO官方发布全球抑郁症患者已达3.22亿人，2005年至2015年间患者数量增加了18.4%。抑郁症是世界范围内的首要致残原因，也是导致全球总体疾病负担的重大因素。抑郁症发病与CUMS密切相关[6]，CUMS可以造成人及大鼠海马神经元结构损伤和可再生能力降低，即海马神经元突触重塑。其次，氟西汀在治疗抑郁症时，常伴有神经元突触重塑相关信号转导通路的调节。表明神经元突触重塑在抑郁症发病机制中可能起到关键作用[6-8]。

突触素(Synaptophysin，SYP)是一种与突触结构和功能可塑性调节密切相关的突触前膜囊泡蛋白[9]。抑郁症中SYP的表达异常[10,11]。而且，CUMS和抑郁症均可表现出海马神经元突触的萎缩和SYP的表达下调，而氟西汀可使SYP的表达升高[12,13,14]。突触后致密蛋白-95( PSD-95)是位于谷氨酸能神经的突触后致密蛋白(postsynaptic densities PSDs)家族中的一种膜相关蛋白，在突触可塑性信号转导中起关键作用[11,15]。而且，抑郁症会表现出PSD-95的表达异常[16-20]。所以，SYP与PSD-95作为突触的特异性标志物及突触核心构建蛋白，在维持突触正常功能和可塑性方面具有重要作用的同时、也是抑郁症药物干预的重要靶点。

本实验在建立大鼠抑郁模型成功的基础上，对抑郁症大鼠进行氟西汀治疗，结果显示：经过28天CUMS干预后大鼠在体重、糖水消耗、旷场试验的活动次数比正常组明显减少，粪便颗数明显增多，中段停留时间和总路程明显少于正常组，表明大鼠兴趣丧失、快感缺失等，氟西汀治疗后这些症状均明显改变。同时发现，CUMS大鼠海马脑区SYP蛋白及mRNA表达水平较正常组显著降低，氟西汀治疗后大鼠海马区SYP蛋白水平升高。同样，CUMS大鼠海马脑区PSD-95蛋白和mRNA水平表达升高，氟西汀治疗后PSD-95蛋白和mRNA水平表达降低。所以，我们推测氟西汀抗大鼠CUMS抑郁作用的机制，可能是通过调控PSD-95及SYP的表达来缓解抑郁症状，改变神经元突触重塑，详细的作用机制还有待进一步的实验研究。