甲状腺乳头状癌组织中G-蛋白偶联受体5和组织蛋白酶D的表达及临床意义

李文翠，高波，张吉才

甲状腺乳头状癌是常见的甲状腺恶性肿瘤，约占甲状腺癌的3/5～4/5[1]。与其他恶性肿瘤相比，大部分甲状腺乳头状癌的病人的手术治疗效果和远期预后较好，但仍然有部分病人存在肿瘤局部侵袭和淋巴结转移，这部分病人的治疗效果及预后都较差[2]，因此寻找甲状腺乳头状癌的高危复发和转移的因素与检验标志物尤为重要，有研究[3-4]提示G-蛋白偶联受体5(LGR-5)和组织蛋白酶D(Cath D)在肝脏、胃肠道、呼吸等系统的恶性肿瘤中均有过表达，并且与疾病的发展和浸润转移相关，但对二者在甲状腺肿瘤中的表达研究较少。笔者检测了LGR5和Cath D在甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织中表达情况，探讨它们的表达与肿瘤浸润和转移的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料纳入2014年1月至2017年3月湖北省十堰市太和医院首诊甲状腺癌病人，通过手术切除癌组织病理活检提示为原发性甲状腺乳头状癌病人67例，其中男性15例，女性52例；大于45岁38例，小于或等于45岁29例；肿瘤直径大于2 cm 34例，小于或等于2 cm 33例；肿瘤有局部侵犯包膜32例，有颈部淋巴结转移37例。所有病人均依据2016年美国甲状腺学会制定的甲状腺癌的TNM标准[1]进行临床和病理分期，Ⅲ+Ⅳ期29例，Ⅰ+Ⅱ期38例。对照组选取相同肿瘤病人距离癌边缘大于2 cm的正常甲状腺组织，光学显微镜下确诊无癌细胞。所有病人都签署了知情同意书，本研究通过了湖北省十堰市太和医院医学伦理委员会批准(G20130278)。

1.2方法

1.2.1试验方法 选择LGR5试剂盒(武汉博士德)，Cath D试剂盒(武汉博士德)，采用免疫组化法检测两组病人甲状腺组织中LGR5、Cath D的表达。一抗兔抗人Cath D多克隆抗体、兔抗人LGR5多克隆抗体稀释成1∶400，放置于4 ℃的冰箱中备用。通过切片-脱蜡-水化-浸泡-阻断过氧化物酶-一抗-二抗-显色-复染-脱水-封片等步骤，最后在切片上滴加适量中性树脂胶，封片，晾干。

1.2.2结果判定标准 LGR5阳性表达位于细胞核或细胞质内，Cath D阳性表达位于细胞质内，呈均匀一致的棕色颗粒。在切片中选取5个高倍视野(400倍)，计数 200个细胞，统计阳性细胞占全部肿瘤细胞的百分比，阳性细胞百分比<10%为阴性，≥10%为阳性。

1.3统计学方法通过SPSS 16.6软件进行统计分析。计数资料用例数及率表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1甲状腺乳头状癌和癌旁正常甲状腺组织中LGR5及CathD的表达甲状腺乳头状癌和癌旁正常甲状腺组织中LGR5的阳性表达率分别为62.69%(42/67)、2.99%(2/67)，差异有统计学意义(P<0.05)。Cath D的阳性表达率分别为70.15%(47/67)、4.48%(3/67)，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。LGR5、Cath D在甲状腺乳头状癌和癌旁甲状腺组织中的免疫组化染色结果见图1，2。

2.2甲状腺乳头状癌组织中LGR5和CathD表达与不同临床病理因素的关系在甲状腺乳头状癌组织中，LGR5和Cath D在较大的肿瘤直径，肿瘤局部外侵，颈淋巴结转移，以及较晚的TNM分期中表达的阳性率较高，差异有统计学意义(P<0.05)；其中部分表达与病人年龄与性别无关(P>0.05)，见表2。

表1 LGR5及Cath D在甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织的表达/例(%)

表2 甲状腺乳头状癌中LGR5和Cath D在不同临床病理因素中的表达

3 讨论

甲状腺乳头状癌总体预后良好，但仍有10%～30%的病人出现早期复发和转移。甲状腺乳头状癌预后不良的主要临床病理因素主要包括肿瘤组织的局部侵袭和颈部淋巴结转移[5-6]。LGR5 作为Wnt信号通路的靶基因和肿瘤干细胞标志物，属于跨膜蛋白激酶受体，有研究表面LGR5阳性的细胞具有分化成为所有的上皮细胞的潜能，其参入肿瘤细胞由幼稚到成熟的过程，对肿瘤内在起到调控的作用，与多种肿瘤的生物学进展密切相关，还是特异性较高的肿瘤标志物[7]；Cath D是一种蛋白水解酶，其能分解基膜和间质I、Ⅲ型胶原蛋白、肌动蛋白及纤维连接蛋白等，促进肿瘤细胞的浸润，其活化后可以溶解并催化基底膜和细胞外基质，使局部形成溶解的区域，此时细胞间通路打开，对肿瘤的恶变和转移有明显促进作用，参入肿瘤的淋巴道转移，对细胞代谢产物加工、细胞内蛋白质代谢、细胞凋亡过程起到重要作用[8]。

本研究发现，甲状腺乳头状癌组织中LGR5和Cath D阳性表达率明显高于癌旁正常甲状腺组织，其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路失调有关，该信号通路可促进肿瘤干细胞的增殖、甲状腺结构破坏、加速肿瘤分化、加快颈部淋巴结转移和血管浸润[9-10]。这与我国卢秀波等[11]的研究结果一致，其运用逆转录聚合酶链反应及免疫组化SP法检测40例甲状腺癌病人组织蛋白酶B(Cath-B)的阳性表达率高达82.5%。国外专家早有研究[12]显示甲状腺癌恶性肿瘤的平均Cath D活性与甲状腺冷良性结节(P<0.001)和Graves病组织(P<0.05)差异有统计学意义，进一步论证了甲状腺癌中Cath D的过表达增加了cath D在肿瘤生长和转移中的潜在作用。国内还有研究[13]表明Cath D在乳腺癌组织阳性表达率明显高于正常乳腺组织，Cath D的表达与乳腺癌临床分期、淋巴结转移、肿瘤体积、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)表达密切相关，进一步证实了Cath D与肿瘤的发生、发展的作用。

本研究还发现，有淋巴结转移者LGR5和Cath D阳性表达率(94.59%与89.19%)明显高于无淋巴结转移者(46.67%与50.00%)，有局部包膜侵犯的肿瘤组织中LGR5和Cath D阳性表达率(87.50%与90.62%)明显高于无局部包膜侵犯的组织，可能是LGR5及Cath D通过旁分泌机制，促进间质成纤维细胞外向性生长、刺激肿瘤新生血管的形成[14]、加速肿瘤细胞的局部浸润与远处转移。研究还发现肿瘤直径越大，TNM分期越高，LGR5及Cath D的阳性表达率越高，与肿瘤的恶性程度和复发转移风险呈正相关。

综上所述，甲状腺乳头状癌组织中LGR5和Cath D的高表达与肿瘤的侵袭和转移密切相关，通过检测它们的表达，对甲状腺乳头状癌的生物学行为可能具有一定的临床意义。

(本文图1，2见插图1-1)