海洋放线菌天然活性产物的发掘

张晓婷，赫卫清*

（中国医学科学院 医药生物技术研究所 卫健委抗生素生物工程重点实验室，北京100050）

海洋是生命的发源地，约占地球表面积的71%，是一个开放、多变、复杂的生态系统[1]。海洋相较于陆地具有高盐、高压、低温、缺氧、低营养和无光照等特殊的生境[2]，正是这些特殊的物理、化学因素造就了生命活动的复杂性、物种资源的丰富性、基因功能的多样性和生态功能独特性[3]。使得海洋来源的微生物能够产生结构新颖且具有活性良好的次级代谢天然产物，微生物来源的天然产物在人类疾病的治疗过程中发挥着重要作用[4]。在抗生素的广泛使用之下，细菌的耐药性迅速增加[5]，多种耐药菌陆续开始出现，如“超级细菌”耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillinresistant Staphylococcus aureus，MRSA）对绝大多数抗生素不再敏感[6]。2016年的G20峰会列举影响世界的深远因素中，特别指出抗生素耐药性是影响全球经济的重大挑战。在规范抗生素使用的同时迫切需要研发新的抗生素来对抗耐药菌的出现。在生物活性天然产物新来源的不断探索的过程中，海洋微生物引起了广泛的关注，并逐渐弥补了土壤微生物来源的不足[7]。

放线菌（Actinomycetes）属于丝状革兰氏阳性细菌，能够产生多种具有生物活性的次级代谢产物，当前发现的天然抗生素中约有70%产自放线菌[8]。目前陆生放线菌经过几十年的研发，发现新菌种和新的活性化合物的几率正在逐渐降低，因此海洋放线菌正逐步成为研究热点。海洋放线菌种类很多，最常见且研究最多的就是链霉菌属（Streptomyces）[9]；链霉菌是一类具有丝状分枝细胞，染色体呈线状的革兰氏阳性细菌，与其他细菌相比，高鸟嘌呤（guanine，G）、胞嘧啶（cytosine，C）含量是其显著特点。链霉菌基因组是目前已知的最大的原核基因组，生理结构复杂使得链霉菌具有较为复杂的发育分化过程，形态分化的同时伴随着复杂的生理变化和大量次级代谢产物的生成。使海洋放线菌成为未来新天然药物开发的一大资源宝库[10]。

目前海洋药物的开发受众多因素的限制，最主要的是因实验培养条件有限，利用传统培养的方法所分离到的海洋微生物低于百分之一[11]，提高海洋微生物的分离培养效率是开发好样药物首要解决的问题，首先需要对传统培养条件进行不断优化；再者开发研究新型培养技术，例如运用模拟自然环境的稀释培养技术来分离筛选到更多的微生物。除此之外宏基因组学和生物信息学也被应用到海洋药物的开发和研究中，通过异源表达、功能基因的筛选、基因组文库的建立等方法在天然产物发掘中的运用对于可持续利用海洋生物资源具有重要意义。

1 优化培养基

海洋环境营养物质浓度低，一般要比实验室培养基低几个数量级，是典型的寡营养环境，海洋微生物往往依赖其共生环境影响其可培养性[12]。JENSEN P R等[13]在培养基中适当的加入海砂和海泥，从而分离到需海水才能生长的高比例海洋特有放线菌。BRUNS A等[14]通过在海洋微生物的分离培养基中添加一定量的环磷酸腺苷（cAMP）、N-丁酰高丝氨酸内酯或含氧己酰-DL-高丝氨酸内酯，使得可培养海洋微生物的数量明显增加。选择性的添加放线菌酮、萘啶酸可以抑制真菌和革兰氏阴性菌的生长，由此可以分离出生长相对缓慢的放线菌。因对不同微生物培养条件（尤其是培养基配方）知之甚少，阻碍微生物的分离培养。OBERHARDT M A等[15]结合NCBI的微生物分类和微生物培养基数据库（DSMZ）等，建立了网址http：//komodo.modeleseed.org，依据传递预测模式（transitive prediction schema）和协同过滤预测（collaborative filtering predictor）。即根据16S rDNA系统进化相似性，根据已知培养基的物种来推断其近缘物种的培养基，大大加速从生态研究到微生物资源的进程。

2 改进培养方法和检测技术

除了摸索各种新型发酵培养基以及对发酵技术的不断优化，许多研究者也不断尝试研发新的培养方法，但大多是模拟自然环境和稀释培养相结合来提高微生物的可培养性。其次一些灵敏度高的检出技术运用到海洋微生物活性挖掘中。

2.1 共培养

实验室人工培养条件下，很多海洋微生物的代谢途径被抑制甚至不表达，而有效的共培养技术可以帮助人们获得多样性更丰富，结构更新颖、活性更显著的次级代谢产物。而常见的海洋微生物共培养包括海洋真菌和海洋细菌、海洋细菌与海洋细菌、海洋真菌和海洋真菌。共培养的过程中，在培养过程中营养成分的减少、生存空间的不足，会使共培养的海洋真菌或者细菌产生一列次级代谢物。所产生的有些次级代谢产物是单独培养所不能产生的。如EBADA S S等[16]将一株米曲霉Aspergillus sp.BM05和一株未鉴定的细菌共培养，分离得到一个新的甾醇类的化合物，经证实此化合物对K562、HCT116、A2780、A2780 CisR人肿瘤细胞系具有一定的细胞毒活性。使纯培养产生的化合物产量提高，是共培养的另一大优势，如CHO J Y等[17]将一株海洋来源的细菌Alteromonas sp.KNS-16和一株链霉菌Streptomyces cinnabarinus PK209进行共培养时，发现二萜类化合物lobocompactol的产量远远高于纯培养。

2.2 模拟自然环境的稀释培养技术

稀释培养是最大程度的模拟海洋环境的寡营养状态，将含微生物的海水或海沙海泥等样品不断稀释，使最后一个稀释度中的微生物含量极低（1～10个细胞），同时补给于未加改动的环境水体作为稀释液和培养液。这种培养方法倾向于选择丰度最大而不是营养感应与耐受性最强的微生物。戴欣等[18]发现稀释培养基上生长的菌量是未稀释的普通琼脂培养基上生长的细菌数量的3～5倍，纯化菌株也可以通过不断的稀释培养获得。

2.2.1 微包埋技术的运用

微囊包埋技术（microencapsulation）是一种行之有效的、高通量的海洋微生物分离技术，微囊包埋技术是在稀释培养的基础上，先将海水和土壤样品中的微生物稀释到合适的浓度，然后制成包埋单个微生物细胞的天然或合成高分子材料的微囊进行培养，基本实现一个微球包一个微生物细胞，一方面起保护作用，另一方面被包埋的微生物处于开放的连续补给的环境中可以随时进行物质交换。AKSELBAND Y等[19]在2005年曾利用微包埋技术从混合样品中分选到生长缓慢的海洋微生物。

2.2.2 菌落转移法

菌落转移顾名思义是在培养过程中将新形成的菌落连续不断地转移到新的平板上继续培养，避免一些寡营养菌在生长延迟期被其他快速生长的菌落所掩盖，菌落转移的培养方法使那些生长周期长，长势弱的非优势菌株得到生长和分离的机会。EILERS H等[20]通过菌落转移的方法从表层海水中分离出许多新的浮游菌，观察到的菌落数是未经菌落转移的平板的5倍，并且细菌的种系组成也会随培养时间的延长而发生变化。

2.2.3 模拟环境的扩散盒培养技术

扩散盒两端封闭于微孔滤膜，将待分离的样品稀释后混合含自然海水的琼脂培养基倒入扩散盒里面的培养室，滤膜只能允许环境中营养物质的通过，但限制了微生物细胞的进出。随着海水的不断流动循环，使整体置于类似于自然水体的环境中进行培养。KAEBERLEIN T等[21]对来源于环境中的微生物进行了培养时，发现多达40%的接种细胞在使用扩散盒时获得了单克隆，连续培养所获得的微生物的数量是传统培养方法实现不了的。同时一些难培养的微生物通过反复培养后可以正常生长，提高了物种的多样性。

2.3 检出技术的创新

随着分析处理样本的增多，传统的筛选检测技术已不能满足需求，需要创造一些高灵敏度的观察、检测技术。再者海洋微生物处于寡营养的生存环境[22]，生存周期相对较长，大多数海洋微生物在可见浊度之前便进入生长稳定期。无疑增加了成活率检出难度，再者加上传统检测技术的限制，检测所得的计算值往往低于真实的成活率。为解决这类问题，近年来发展了一些高通量的分选技术。如LIU W等[23]发明了微流体方法，使培养和分选同时进行，允许单个微生物的分选，孵化和克隆体系的分离，用于更深层次的研究。将流式细胞技术在生物技术最广泛的应用就是细胞筛选，PORTER J等[24]将流式细胞技术同荧光抗体相结合实现对湖水和污泥样品中E.coli细胞的分选和富集。除此之外，细菌染色计数、双链核酸染色计数等方法应用于海洋微生物的检测中，用来提高可培养海洋微生物的比例[25]。

2.4 微生物影像质谱法的应用

质谱成像是以质谱技术为基础的成像方法。该方法可以通过质谱直接扫描生物样品成像，将扫描结果传输到专业处理软件，通过对生物组织切片直接分析，可以得到指定质核比相应化合物的密度图，由此快速、全面、高通量的实现对切片组织中化合物的组成，相对丰度以及分布情况进的分析。在研究微生物相互作用过程中天然产物生产的空间和时间信息方面，影像质谱技术有别于其他检测技术的优越性。因此近年来成为研究天然产物的有力工具[26]。BARGER S R等[27]尝试利用影像质谱方法分析Steptomyces sp.Mg1和野生型B.subtilis 3610之间存在相互作用。LIU W T等[28]利用影像质谱技术，从一株生产达托霉素的工业菌株S.roseosporus中分离得到了一种抗感染化合物arylomycin。赵心清等[29]通过影响质谱法对海洋链霉菌的研究过程中发现了产多烯类化合物的菌株。

3 从基因层面深度挖掘

海洋微生物可培养技术和检出技术近年来得到了一定的发展，但仍然无法满足人类探索海洋的迫切需要，一方面需要创建一些新的更能模拟海洋环境条件的培养方法，为海洋微生物资源的保护和利用提供更多的新菌株；另一方结合宏基因组学、分子生物学技术等先进的技术在基因层面进行深度的挖掘。

3.1 基于16S rRNA的海洋生物多样性的研究

16S rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适，其为细菌所共有功能同源且进化最为古老，既含有恒定的保守序列用于设计引物又含可变序列来区别种属间的差异；再者生物体内为多拷贝存在，分子大小适合遗传操作；它的序列变化与进化距离相适应具有良好的时钟性质。目前，16S rRNA 基因序列作为微生物的系统发育和未知菌的鉴定已被广泛应用于海洋微生物多样性的研究当中，并取得了一些有意义的结果。戴欣等[30]通过构建16S rRNA基因库来分析中国南海南沙海区沉积物中的细菌多样性，发现沉积物样品中细菌16S rRNA基因序列与基因库中已知的细菌的16S rRNA 序列差异较大，但主要来自变形细菌和浮霉状菌目等类群，这一结果表明在中国南沙海区沉积物中潜藏着丰富的微生物资源。

3.2 宏基因组文库构建

宏基因组是指直接提取样品的总DNA来获得特定环境或共生体内所有生物遗传物质，然后将获得的遗传物质克隆到相应的载体上转入可培养的宿主细胞中，从而构建宏基因组文库，再从所获得的重组克隆子中筛选能产生活性物质的相关基因（簇）。是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术，克服海洋微生物难培养的问题，极大扩展了海洋微生物资源的利用空间，提高了新活性物质的获得机会。随着高通量基因组测序技术的发展以及逐渐降低的测序费用，越来越多的海洋微生物基因组信息被获得和公开。根据在线基因组数据库GOLD（Genomes OnLine Database）[31]2018年的更新信息，目前已经测序完成的基因组有295 088个，其中细菌的基因组有261 909个，放线菌登录基因组有36 773个（http：//www.genomesonline.org）。

3.3 基因筛选

基因筛选方法也被广泛用于分析海洋微生物合成某些天然产物潜能的研究中，即通过分析某生物合成关键酶的保守区域，然后设计相应的兼并引物，进而通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增来寻找此关键酶的阳性菌株，并获得特异酶基因的序列，该序列也可作为探针在基因组文库中筛选阳性菌株，从而找到化合物生物合成基因簇[32]。HORNUNG A等[33]根据合成相关的卤代酶的氨基酸序列，设计了简并引物从阳性菌株中克隆了包含卤代酶基因及与其连锁PKSII型基因的整个抗生素生物合成基因簇。本实验室根据链霉菌中含糖次级代谢产物的一个糖基脱水酶基因（dTGD）的保守区域设计了一对简并引物[34]。并对90株海洋来源的微生物进行了dTGD基因的PCR筛选，分析dTGD基因在海洋来源微生物中的分布情况。从所获得的dTGD基因阳性菌株中选取约50株，对其dTGD基因的PCR产物进行测序，并通过BLAST-p分析预测阳性菌株中潜在含糖天然产物的化学结构类型。但基因筛选方法也存在一定的问题：即兼并引物的设计需依赖现有的酶基因，限制了对新酶基因和未知天然产物的发现；基因簇的分离和生物合成途径进一步分析还需要与基因组文库相结合进行；实验设计的目标酶基因可能只存在于有限种类的菌株中降低了筛选效率等。

3.4 异源表达

用于宏基因组克隆的常用载体有柯斯质粒（Cosmids）、Fosmids、和细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome，BAC）。其中前两者适合中等片段的插入克隆，而BAC常用于大片段的克隆[35]。且BAC克隆株可以在同源和异源宿主中进行功能表达，这在宏基因组克隆中受到广泛关注。目前作为宏基因组克隆表达的原核生物反应器常用的菌株一是大肠杆菌[36]，但大肠杆菌适合低GC小片段的表达，对于高GC大片段基因表达不太合适；二是链霉菌大部分的抗生素都是有链霉菌产生的，链霉菌具有天然生产机制，编码次生代谢产物生物合成基因成簇分布。这些分子基础使得链霉菌成为异源表达最好的表达宿主。一个基因簇的完整表达不仅需要具有良好的启动子、增强子、开放阅读框等表达元件，还需要合适的物理化学因素诱导，再者与宿主菌株的基因组兼容也是必不可少的因素，这些在实际研究中都需要解决。

4 展望

由于海洋生物与陆地生物生存环境的不同，使得海洋生物次级代谢产物与陆地生物相比有着更大的化学多样性。解决对陆生微生物来源的药用先导化合物发现日趋困难的问题，海洋微生物来源次级代谢天然产物成为新药物先导化合物的研究热点。一是通过对传统筛选方法的优化以及培养技术的改进来提高海洋微生物的可培养性。再者推进基因组学的发展，加大海洋微生物基因组测序的力度，利用生物信息学手段全面了解其代谢调控网络；建立适用于海洋微生物异源表达体系；建立通用的可拆卸/插入的DNA克隆表达元件库，为应用合成生物学手段改造和构建新的海洋微生物代谢途径奠定基础。