MALDI-TOF MS技术及其在食品微生物检测方面的应用

顾春华

（甘肃省食品检验研究院，甘肃 兰州 730000）

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术是近年来发展起来的一种非常瞩目的软电离技术方法，该技术使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革，其不但适用于蛋白质、多肽等生物大分子的高通量筛选，还可以对寡核苷酸、基因的单核苷酸多态性、微生物鉴定分型等进行分析，其优点是：（1）软电离，不会把分子打碎；（2）检测范围宽，最大可达400 kDa；（3）可以检测混合物；（4）对盐/污染物容忍性好[1]，因此，在蛋白质组学[2]、基因研究[3]、临床医学[4-5]等领域得到了广泛应用。尤其对于临床微生物的鉴定，MALDI-TOF MS技术可快速鉴定以前难以培养的厌氧菌（分枝杆菌（Mycobacterium）、真菌等）至种、亚种水平，操作简单、速度快、成本低，且数据库可不断完善[6-7]。

目前，食品微生物的鉴定技术主要包括建立在形态学、细胞生理学、生物化学水平上的经典生理生化方法，以及逐步成熟的分子生物学方法。其中，经典生化方法虽具有权威性，但操作繁琐，检测周期长。分子生物学方法虽然将鉴定水平提升至核酸分子，但仅能鉴定至属，对种和亚种尚不能有效鉴定，而且要通过细菌脱氧核酸（deoxyri bonucleic acid，DNA）提取、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增、琼脂糖凝胶电泳、序列测定与比对等复杂过程[8-9]。而MALDI-TOF MS技术虽然相比较上述方法有了质的飞跃，发展势头也很迅猛，但在食品微生物检测领域的应用上[7]，还是有一定的局限性，不如临床微生物普及率大。本文将从食品微生物的培养条件、MALDITOF MS设备、数据库、方法标准的局限性等方面对这一现象进行阐述。

1 MALDI-TOF MS技术原理和关键因素

MALDI-TOFMS技术是基质辅助激光解吸电离（MALDI）技术与飞行时间质谱（TOF MS）的结合[10-11]。基质辅助激光解吸电离（MALDI）技术于1987年由HILLENKAMP F及KARASM首次提出[12]。其原理是将待测物混入基质中并被基质包围，通过激光轰击待测样品与基质形成的共结晶薄膜，由于基质浓度远高于待测物浓度，基质分子吸收大部分激光能量，瞬间由固态转变成气态，形成基质离子，在待测物与激发出的基质离子的碰撞中，发生了待测物的离子化，在这个过程中，并不会导致高分子发生链断裂，通常只生成分子离子及分子离子的多聚体[13]。飞行时间质谱（TOF MS）在20世纪40年代中期首先由STEPHENS W E提出[15]。其原理是在加速电压和飞行距离一定的情况下，被电离的待测物质的质子数与电荷数的比值（m/z）与飞行时间的平方成正比。电离的生物分子在电场作用下加速通过飞行管道，根据到达检测器的时间及离子的数量，得到了横轴为m/z、纵轴为峰强度值的图谱，从而被质量分析器检测[15]。

在MALDI-TOF MS技术中，靶板上的基质对最终的检测结果起着重要作用，它的主要功能是吸收脉冲激光的能量，另外要使基质能够很好地分散样品分子，防止其聚集，提高电离效率，并且还不能破坏待测分子。首先要求基质对激光光源有很强的吸收，因此大多数基质化合物均为含苯环的有机化合物；第二要求基质与被测分子具有很好地相容性，同时不能有分子间的相互作用，所以得到一个合适的基质并不容易[16-17]。目前，根据待测物和实验目的的不同，通常选用的基质有2,5-二羟基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）、α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）和芥子酸（sinapic acid，SA）等，在这些基质中添加一些合适的添加物，形成共基质在实践中也是常见的。如将0.1%的甲酸加入基质溶液，可以部分抑制来自培养基的盐污染，提升实验效果。一般情况下，DHB用于寡糖、糖肽和糖蛋白的研究，它适用于小分子质量组分，而CHCA一般用于蛋白质的研究[18]。同一物种质谱图谱的不同，有时取决于所使用的基质，而基质的选择则取决于对待测物的研究。

合成高分子的离子化在一般情况下是金属离子阳离子化，很难通过加质子使其离子化，往往需要加碱金属盐类或银铜等金属盐类形成离子络合物达到离子化目的。对于含胺官能团的化合物（如蛋白质、多肽），可与基质提供的氢离子直接质子化，不需直接加金属离子[19]。

微生物有其自身独特的蛋白质组成，可以将由MALDITOF MS获得的菌种图谱与数据库中的参考谱图做对比，通过观察特异峰的位置和强度，然后根据同源性距离得到最接近的菌种并给出相应的鉴定分值。鉴定分值代表待测物与数据库的参考菌株比对后的可信水平，最终可得到鉴定结果。而且MALDI的电离方式为软电离，可使整个蛋白分子在离子化过程中都能够保持完整，得出的质谱图会让不同大小的分子有序排布，这样就便于对谱图进行分析。通常，鉴定分值在1.99～2.30之间为满足种鉴定，1.70～1.98之间为满足属鉴定、种可接受，分值在1.70以下为不可信，需要重新鉴定、查找原因或选用其他方法。菌种培养后的鉴定方法十分简单，一种为取少量菌落直接点靶，加1μL基质（CHCA溶于10%三氟乙酸与70%乙腈制成的过饱和溶液）充分混匀，干燥后上机；另一种将少量菌落溶解于蛋白提取液（10%三氟乙酸与70%乙腈等量混匀）10 μL中，充分研磨裂解，1 μL裂解液点靶，再加1 μL基质，干燥后上机。

2 MALDI-TOF MS技术检测的局限性

2.1 培养条件和样品处理方式

MALDI-TOF MS技术目前仍依赖于培养，需要培养后的纯菌株用于鉴定[20]。其鉴定依据包括（1）不同微生物的光谱指纹图谱不同；（2）在光谱中，被检测到的蛋白质的峰（分子质量）对某些属、种，甚至亚种是特异的；（3）在相同的培养条件下所获得的微生物谱图是可重复的。有时，同种的微生物得到了不同的质谱图，是由于其生长条件的不同或不同的化学提取方法导致的。因此，选择最合适的培养条件和控制标准化的样品制备方法是获得可重复质谱图的必要条件，在建立标准化方案时必须考虑，也就是基质、培养基、温度、湿度及培养时间的不同均会影响微生物蛋白的表达，使图谱发生变化[21]。CONWAY G C等[22]研究了培养基种类和培养时间对大肠杆菌（Escherichia coli）的影响，结果表明培养基的种类和培养时间均能影响菌种特异峰的出现，导致谱图发生变化；HORNEFFER V等[23]在鉴定枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）时，研究发现不同类型的培养基对蛋白图谱有影响。但也有研究表明，虽然培养基、培养基温度及培养时间的不同均会导致菌种蛋白质图谱发生变化，但对最终鉴定结果影响较小，鉴定结果仍然是可信的[24-26]。DIECKMANN R等[27]研究发现，采用基础培养基和选择性培养基得到的细菌蛋白图谱，其特异峰基本一致；MADIGAN M T等[28]进一步研究了生长在固体琼脂培养基和肉汤培养基的菌种产生蛋白图谱差异的原因，发现可能是固体琼脂上的菌落，中间的细胞相对于周边的细胞年龄要大一些，而生长在肉汤中的培养物，它们的生长基本是同步的。因此，只要将实验条件控制好，技术的重现性还是不错的[29]。DIECKMANN R等[27]检验了CHCA、DHB、SA三种不同基质对沙门菌属（Salmonella）的不同种及亚种的MALDI-TOF MS分析效果，结果表明，芥子酸（SA）对沙门菌属的鉴定结果更好，SA更易与分析样品混合均匀，使样品靶上的各个位置解吸效果相似。另外，干燥后样品靶点的厚度和稠度等因素都会对谱图质量产生一定的影响。

2.2 检测设备

MALDI-TOF MS技术发展至今虽然有很多的优点，但还存在仪器本身的全谱灵敏度、分辨率和质谱、光谱重现性不佳，灵敏度、可靠性较差等缺点[30]，因此人们普遍认为MALDI-TOF MS不是定量的分析手段，在食品微生物检测应用中的进一步推广也受到影响。要从应用角度解决MALDI-TOF MS定量分析，可以从样品前处理、点样方式和仪器本身的定量分析误差等几个方面着手。首先，样本与基质分子形式的结晶层在MALDI靶板上的分布是不均的，而且此类仪器采用的氮气激光器的发射频率通常被限制在50 Hz左右，所以通常在单位时间内仅有一小部分（通常＜1%）样品分子被激光照射电离和分析，使每个叠加后的质谱图中离子强度重现性非常不稳定，误差会高达30%以上。其次，MALDI-TOF MS设计中无法对不同大小离子在初始空间及速度上同时完成聚焦，加上通常MALDI-TOF激光照射入射角度的不对称性，使得传统MALDI-TOF MS仪器设计中有造成质量偏倚性的许多因素，在不同质量区间的分辨率、灵敏度有较大的区别。

2.3 数据库

数据库是MALDI-TOF MS的核心，待检测微生物只有在数据库里有相应的质谱图才可能被鉴定。数据库不仅要包含微生物所有的属，也应包括种甚至亚种，因此，有一个完善的质谱数据库意义重大。有两个策略用于数据库的建立，第一种策略是建立一个比较大的数据库，包含每一个菌种的所有峰值信息，这就要求将每个菌种的所有参考菌株的信息全部纳入其中，以便鉴定某菌株时可以产生良好的匹配。第二种策略是仅保留菌种的个别高强度特征峰值信息，这种方式对生长条件不同的菌株影响较小，匹配度较高[26]。有研究[31]关注不同的MALDI-TOF MS设备对匹配数据库是否有影响，结果发现，对同一样品不同设备产生的谱图很接近，有60%的峰是重合的，大多数的差异仅仅是峰强度的差异。尽管因质谱模式改变导致谱图有所改变，但多数峰是保守峰，这些保守峰可以被用作鉴定微生物的潜在标记物。而对于有些微生物未能被鉴定出来，或许因为它是新的物种或新分类，可以将新发现的物种添加到数据库，按照物种分类不断地去完善数据库[32]。或者可以将一些不常见物种建立自己的内部数据库，但这对于一般的常规实验室仍然很难实现。因此，建立一个强大的数据库仍然是科学家致力去突破的一个方面，尤其对于食品微生物，还没有专门的商业化数据库开发出来。

2.4 方法标准

方法标准的建立和发布是检验和技术交流的依据，也是食品安全监督检查和仲裁的依据。目前关于MALDI-TOF MS技术的微生物检测标准已经发布实施的只有GB/T 33682—2017《基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则》和SN/T 3872—2014《出口食品中四种致病菌检测方法MALDI-TOF-MS法》。第一个标准是通则标准，针对性和可操作性均不强，第二个标准只涉及沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogens）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）和霍乱弧菌（Vibrio cholerae），对于极其复杂、种类繁多的食品微生物来说显然是不够用的。建立一套完整的标准体系对于MALDI-TOFMS技术在食品微生物方面的应用扩展非常重要，它会加速将MALDI-TOF MS技术普及到各个级别的实验室中，使之成为一种常规检验。

3 讨论和展望

近年来，MALDI-TOF MS已经成功应用于微生物的鉴定，显示了其在细菌、酵母菌，真菌等鉴定方面的较强优势。SENG P等[33]在实验室对1 660个菌株进行了鉴定，将单克隆直接点于靶板上，每个单克隆点4个靶点，如果有2个或以上靶点鉴定的值是可信的，则认为这个鉴定是有效的。结果只有260个单克隆仅凭2个靶点阅读未能得到鉴定，通过继续阅读剩余的2个靶点，则全部得到了鉴定。这项研究证实了MALDI-TOF MS技术的优越性：具有95%以上的鉴定正确率，其中84%鉴定到种的水平，11%鉴定到属，有2.8%未能鉴定出，有1.7%尽管鉴定分值很高，但鉴定结果是错误的。同时，研究发现，MALDI-TOF MS技术与革兰氏染色间没有任何差异，可以将MALDI-TOF MS技术作为微生物鉴定的第一步，而无需先进行革兰氏染色。这些研究成果肯定了MALDI-TOF MS技术在实验室的重要地位。VAN VEENV等[34]的实验方法与SENG P等[33]类似，只是对于鉴定不出来的每个菌株，增加了提取步骤，并且再次增加了2个靶点去进行识别。结果得到了97%的正确鉴定（92%鉴定到种，5.1%鉴定到属）。在这项工作中，有61株酵母菌（分布于7个属和12个种）也得到了鉴定，其中85.2%正确鉴定到种，96.7%正确鉴定到属。这表明该技术非常有效，非常适合高通量样品检测，同时研究者也强调了数据库的不完整、某些物种的缺失和扩充数据库的必要性。

MALDI-TOF MS技术提供了一种快速、准确、廉价和高通量的微生物鉴定方式。有报道将不经过任何处理的经过细菌污染的样品，利用数据库的蛋白图谱可以鉴定存在的细菌[35]。这预示着MALDI-TOF MS的宽谱定量已经有了初步的尝试。纵然有这些优点，但在重复性、定量方面，经过众多的改进，仍然没有统一的方案解决，商业化的数据库也还需要不断完善和强大。

我国在MALDI-TOF MS领域的发展也突飞猛进，一批具有自主研发和生产能力的企业都推出了自己的产品，开发了诸多新型应用，建立了一些特色数据库，相信在不远的将来，随着各种鉴定技术的联合使用，或自身技术的突破，定能实现混合菌的检测，或直接样品的微生物检测，而MALDI-TOF MS也有望成为首个由中国企业掌握全球领先技术和应用的通用型质谱仪。