二氧化氯对果胶杆菌(P.carotovorum subsp.carotovorum)抑制效果的研究

乔勇进，甄凤元，刘晨霞，高春霞，王 晓

(1上海市农业科学院农产品保鲜加工研究中心，上海 201403；2上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200235 )

果胶杆菌(P.carotovorumsubsp.carotovorum)是一种危害广泛的植物病原菌，能够侵染白菜类蔬菜、马铃薯、胡萝卜、洋葱、辣椒、大蒜、人参、君子兰、魔芋、郁金香、马蹄莲等植物[1]，破坏力强，危害较大。目前，国内外对果胶杆菌的致病机理以及抑制方法研究较少。二氧化氯是国际上公认的最新一代的高效、广谱、安全的杀菌剂和保鲜剂，具有适应面广、使用剂量低、效果好、反应快、无毒、无副作用等优点[2-3]，但是二氧化氯对果胶杆菌的抑制研究鲜有报道。

果胶酶系和纤维素酶系在植物病原菌侵染的过程中起着关键作用，可以破坏植物的细胞壁结构，分解利用植物细胞和组织内营养成分，引起细胞死亡[4]。本试验采用二氧化氯处理果胶杆菌，研究二氧化氯溶液对果胶杆菌活力以及致病相关酶活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

果胶杆菌(P.carotovorumsubsp.carotovorum)由自然发病的杭白菜软腐病病斑上筛选分离得到，纯化后于4℃保存，备用。

1.1.2 试验仪器

分光光度计(752紫外可见分光光度计)、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、恒温水浴锅、电子天平等。

1.1.3 培养基配方

二氧化氯(食品级)及其他试剂(分析纯)在国药化学试剂有限公司购买。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1 000mL，灭菌后备用。

LB固体培养基：依照LB液体培养基，每1.0 L再加入15g琼脂，灭菌后备用。

细胞壁降解酶诱导培养基：参照Marcus L等[5]的方法。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂的配制以及标准曲线的制作

(2)取二氧化氯母液和无菌水分别配制浓度为1.01 mgL、4.03 mgL、7.02mgmL的二氧化氯溶液，备用。

还原糖标准曲线的制作：按照表1，分别将试剂加好后摇匀，冷却至室温后定容至25 mL，540nm下测定波长。

表1 还原糖标准曲线的制作

半乳糖醛酸标准曲线的制作方法与还原糖标准曲线制作方法相同。

1.2.2 二氧化氯溶液对果胶杆菌的处理方法

1.2.2.1 果胶杆菌生长曲线的测定

参照李淑英等[6]的方法进行。将50个锥形瓶装的LB液体培养基平均分为五组，编码为A、B、C、D、E组(每组10个平行)，分别加入100μL菌悬液，其中A、B、C、D和E五个处理组再分别加入0 mL、1.28 mL、2.63 mL、4.05 mL和5.56 mL的二氧化氯母液，于25℃下振荡培养，2h后取出各组的1号锥形瓶即A1、B1、C1、D1、E1放置于4℃冰箱，随后每隔2h按各组编号从小到大依次取出锥形瓶并放入冰箱，待培养20 h后测定OD值。

1.2.2.2 果胶杆菌存活率的测定

将1.2.2.1中培养20 h后的菌悬液分别稀释至原浓度的10-1、10-2、10-3、10-4，吸取10-3、10-4菌悬液100.0μL，涂布平板，静置10min后于恒温培养箱25℃培养36 h，记录平板上的细菌总数，按照公式(1)计算细菌存活率。

(1)

1.2.2.3 果胶杆菌细胞膜透性的测定

参考文献[7]，取培养3d的菌液10mL在4℃下离心，弃去上清液后，用吸水纸吸取菌体表面的水分，各取1g，离心后菌体放入含有0.25mgL、0.5mgL、0.75mgL、1.0mgL四种浓度二氧化氯的锥形瓶中，用电导仪测定溶液电导率记，为C0，然后在100 rmin、25 ℃震荡培养，分别在0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min 测定菌体浸出液的电导率，记为Ct。测完后，将所有三角瓶放置于沸水中煮沸15 min，以杀死菌体细胞，待冷却至25 ℃后再次测定各电导率值，记为C。根据公式(2)计算相对电导率值(%)，用相对电导率表示菌体细胞膜的通透性。试验重复3次，每个处理设5个平行。

(2)

式中：C0-0min时测定的的电导率值；Ct-各时间测定的电导率值；C-煮沸后测定的电导率值。

1.2.2.4 细胞壁降解酶活力的测定

(1)果胶酶(PG)活力测定

取0.5%果胶1.9mL，50℃的条件下预热10min，加0.1mL酶液，50℃条件下反应30min，加入1.5mL DNS(3,5-二硝基水杨酸，3,5-Dinitrosalicylic acid)，沸水浴5min，定容至25mL，测定540nm下波长。

(2)聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活力测定

取1%果胶1.5mL，30℃的条件下水浴30 min，加入0.5 mL酶液，在30℃的条件下反应30 min，加入1.5 mL DNS，沸水浴5 min，定容至25 mL，测定540 nm下波长。

(3)甲基纤维素酶(CX)活力的测定

取0.51%羧甲基纤维素(CMC)溶液1.5mL，50℃预热10min后，加入0.5mL酶液，50℃的条件下，反应30min，加入1.5mL DNS，沸水浴5min，定容至25mL，测定540nm下波长。

(4)β-葡萄糖苷酶(GLU)活力测定

1.2.2.5 果胶杆菌致病力的测定

取杭白菜叶柄基部切4 cm左右的茎段，75%酒精擦拭消毒，下衬一张无菌滤纸，置于无菌培养皿中，并加入2.0 mL无菌蒸馏水保持湿度。用灭菌小刀在其中心划2 mm×2 mm的十字型伤口，深度为1.5 mm 左右，取10 μL的经不同浓度二氧化氯气体处理、浓度为105个mL果胶杆菌菌悬液加入十字形伤口处，重复5次。用封口膜将培养皿封口于25℃培养。每隔3 h观察其发病情况，测量病斑长度，每组20个平行处理，并按公式(3)计算发病率。

(3)

2 结果与分析

2.1 不同浓度二氧化氯对果胶杆菌生长曲线的影响

生长曲线是反映微生物总量随时间变化的过程，可以看出微生物对培养基适应的快慢程度以及对培养基成分的利用情况[8-9]。如图1所示，二氧化氯对果胶杆菌的生长有明显抑制作用，且随着二氧化氯浓度的升高，抑制效果明显加强。在培养14h后，0.75 mgL、1.0mgL组的生长曲线趋于稳定，0.25mgL、0.5mgL组的生长曲线虽然有小幅度的上升，但与对照组差异显著(P<0.05)。在培养20h后，0.25mgL、0.5mgL、0.75mgL、1.0mgL的二氧化氯对果胶杆菌的抑制率分别为17.9%、26.4%、45.9%、66.6%，其中1.0mgL组的抑制效果最佳。

2.2 不同浓度二氧化氯对果胶杆菌存活率的影响

细菌的存活率能够反映外界环境条件对活细菌比例影响。如图2所示，随着二氧化氯浓度的升高果胶杆菌的存活率逐渐降低，且各处理组之间差异性显著(P<0.05)，说明二氧化氯对果胶杆菌有致死作用。1.0mgL组的细菌存活率只有对照组的17.18%。

图1 不同二氧化氯浓度对果胶杆菌生长的影响Fig.1 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on growth of pectobacterium

注：不同小写字母表示经Duncan差异显著性检测不同处理组在0.05水平差异显著(n=10)，下同图2 不同二氧化氯浓度对果胶杆菌存活率的影响Fig.2 Effects of different concentrations of chlorine dioxide onsurvival rate of pectobacterium

图3 不同二氧化氯浓度对细胞膜渗透率的影响Fig.3 Effects of different concentrations of chlorine dioxide onpermeability of cell membrane

2.3 不同浓度二氧化氯对果胶杆菌细胞膜渗透率的影响

如图3所示，不同浓度的二氧化氯溶液对果胶杆菌细胞膜渗透性的破坏程度不同。随着处理时间的延长，各组的细胞膜渗透率均呈现先增加后平缓的趋势。细菌细胞膜渗透率的变化主要在前30min，之后，对照组、0.25mgL、0.5mgL、0.75mgL处理组的细菌细胞膜渗透率趋于稳定，而1.0mgL处理组的细胞膜渗透率继续增加，于120min后趋于稳定。表明高浓度的二氧化氯处理能够作用于果胶杆菌的细胞膜，破坏其选择渗透性，影响细胞内外的物质交换，从而抑制细菌的生长繁殖。

2.4 不同浓度二氧化氯对果胶杆菌果胶酶活性的影响

果胶酶是指分解果胶的一种多酶复合物，腐败菌通过分泌PG破坏寄主的细胞壁结构，使其能够吸收寄主的营养寄生[10-11]。如图4所示，在培养过程中，PG活性呈现先迅速升高后趋向平稳，最后下降的趋势。3d时，各组的PG活性达到峰值，对照组最大，为21.5 U，而0.25 mgL、0.5 mgL、0.75 mgL和1.00 mgL组的果胶酶活性分别为19.3 U、16.4 U、14.9 U和9.7 U，说明二氧化氯处理能够显著抑制果胶杆菌产生的PG活性。

聚甲半乳糖醛酸酶是属于果胶酶系的一种能够催化果胶分子多聚α-(1,4)-聚甲半乳糖醛酸的裂解酶。在果胶杆菌的致病过程中可以起到分解寄主表皮细胞中果胶的作用[12-13]，如图5所示，PMG活性曲线与PG曲线趋势相似，均在第3天达到峰值，且各个二氧化氯处理组的PMG活性显著(P<0.05)低于对照组，仅为对照组的88.7%、76.7%、61%和32.6%。

培养后期，由于培养基营养内营养物质消耗殆尽，PG、PMG活性迅速下降。

图4 不同二氧化氯浓度对PG活性的影响Fig.4 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on PG activity

图5 不同二氧化氯浓度对PMG活性的影响Fig.5 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on PMG activity

2.5 不同浓度二氧化氯对果胶杆菌纤维素酶活性的影响

聚甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶都是纤维素酶系中的一种，能够降解纤维素，是植物病原菌所分泌的重要致病因子，在植物的致病过程中分解植物表皮细胞的纤维素，引起细胞壁损伤以及组织浸解[14-15]。如图6所示，在整个培养期间，CX活性呈现先升高后降低的趋势，峰值在第4天，晚于PG、PMG，且活性较低，1 mgL二氧化氯组的CX活性仅为对照组的30.4%。之后，随着二氧化氯浓度的升高，酶活性显著(P<0.05)降低，说明二氧化氯能够有效抑制CX活性，且与浓度呈正相关。

如图7所示，GLU活性的变化趋势与CX相同，均在第4天达到峰值，其中对照组的GLU活性为0.77U， 0.25 mgL、0.50 mgL、0.75 mgL、1.00 mgL组的GLU活性分别为0.63 U、0.55 U、0.46 U、0.21 U。之后，随着二氧化氯浓度的升高降低，说明二氧化氯处理能够抑制GLU活性，其中1.00 mgL处理组的抑制效果最佳。

图6 不同二氧化氯浓度对CX活性的影响Fig.6 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on CX activity

图7 不同二氧化氯浓度对GLU活性的影响Fig.7 Effects of different concentrations of chlorine dioxide on GLU activity

二氧化氯质量浓度∕mg·L-1时间∕h81420263238CK12.3 d18.7 e25.3 e32.3 e39.7 e49.7 e0.148.7 c14.7 d20.7 d27.3 d33.7 d40.7 d0.574.7 b8.0 c12.0 c16.0 c21.7 c28.7 c1.00 0.0 a 4.3 b6.7 b11.3 b14.7 b18.3 b

2.6 不同浓度二氧化氯对果胶杆菌致病力的影响

杭白菜的发病率是衡量果胶杆菌致病力强弱的主要指标。从二氧化氯气体处理杭白菜茎段损伤接种后的病斑直径和发病率情况可以看出，0.14 mgL、0.57 mgL和1.00 mgL均能抑制杭白菜软腐病的发生，对照组处理的杭白菜在接种20 h后，其茎段病情指数达到100%，病斑直径为25.3 mm，到第38小时其病斑直径为49.7 mm，而此时，0.14 mgL、0.57 mgL和1.00 mgL处理组的病斑直径分别为40.7 mm、28.7 mm、18.3 mm，与对照组差异显著(P<0.05)(表2)，说明二氧化氯气体对果胶杆菌的抑制作用随着浓度的升高逐渐增大。接种后38 h发病情况如图8所示，0.14 mgL、0.57 mgL处理组病情指数分别为80.0%、65.0%；1.00 mgL处理组杭白菜茎段在接种后14 h开始发病，在第38小时其病情指数为55.0%，说明二氧化氯气体处理对果胶杆菌的抑制效果与其浓度呈正相关。

图8 第38小时不同处理组杭白菜的病情指数Fig.8 At the 38th hour，the cabbage disease index of different treatment groups

3 结论与讨论

二氧化氯作为一种新型广谱、高效、环保的杀菌剂，近些年已经被广泛应用于食品抑菌防腐保鲜行业。其应用于杀菌的机理主要是其具有强氧化性，可以穿透细胞膜，破坏细菌细胞膜的通透性从而破坏细菌细胞的物质交换，导致细菌生长繁殖受到抑制。Wang等[16]用二氧化氯处理蚕微孢子虫孢子后，蛋白质、多糖、钾离子、钙离子从细胞中漏出，导致孢子因细胞膜透性增加，失去活性。二氧化氯液体处理组中，1.00 mgL处理组的浸提液中可溶性蛋白的含量0.93 mgg，说明二氧化氯气体处理可以破坏果胶杆菌细胞膜的渗透性，使细胞内可溶性蛋白渗出，影响细菌细胞正常生理功能，从而抑制果胶杆菌的生长。微生物生长曲线可以直观地显示其生长规律，反应微生物对环境的适应程度以及对培养基成分的利用情况。本研究加入二氧化氯溶液后，细菌的生长速度明显下降，且随着浓度的增大，抑制效果愈明显。Boddie等[17]利用二氧化氯处理牛乳，可以减少其中80%—90%的奥利斯葡萄状球菌和链球菌，在牛初乳中加入0.5%的二氧化氯溶液，可三个月不霉变，延长贮藏期。本试验中，1.00mgL二氧化氯处理果胶杆菌后，其存活率降低为17.18%，说明二氧化氯具有使用剂量低且高效的优势，与前人的研究结果一致。

果胶杆菌是白菜类蔬菜软腐病的主要致病菌，其寄主范围广泛，侵染能力较强。目前对于果胶杆菌的致病机理国内外都有研究，果胶酶系和纤维素酶系在植物病原菌侵染的过程中起着关键作用，可以破坏植物的细胞壁结构，分解利用植物细胞和组织内营养成分，引起细胞死亡。田红炎等[18]等使用 60 mgL 二氧化氯溶液浸泡处理受损后猕猴桃20 min，可以显著降低其腐烂指数。本研究将果胶杆菌菌悬液接种于损伤杭白菜茎段，发现杭白菜软腐病的发病情况与前人研究一致，首先，损伤组织被侵染发病，随后病斑不断扩大，导致组织水浸腐败。试验结果显示，二氧化氯气体处理对杭白菜茎段损伤接种后的病斑直径的扩展以及发病率有一定的抑制作用，经二氧化氯气体处理后的果胶杆菌，其病斑扩展速度比对照组扩展速度慢；1.00 mgL二氧化氯气体浓度以上的处理组，接种14 h后发病，从果胶杆菌接种到发病的时间显著延长，说明二氧化氯气体处理对果胶杆菌的致病力有一定的抑制作用。Kan[19]研究指出，细胞壁降解酶可以降解细胞壁多糖，破坏细胞壁，使原生质体失去原有的支持力，引起细胞膜变形破裂，使寄主死亡。本研究发现二氧化氯可以抑制果胶酶系、纤维素酶系等细胞壁降解酶的活性，从而降低了果胶杆菌的致病性，说明二氧化氯在抑制果胶杆菌的致病性方面有很好的效果。