冷等离子体食品杀菌应用研究进展

张 晔，刘志伟*，谭兴和，郭红英，王栏树，成才良

（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；3.湖南佳宴食品有限公司，湖南 长沙 410123）

为了给消费者提供营养、安全和货架期稳定的食品，在生产加工过程中通常会对食品进行杀菌处理。传统的热杀菌法虽然可以有效地杀死各种微生物，但是高温处理会改变食品的结构对其营养成分和感官品质造成较大的影响，不适用于热敏性和易挥发性食品的杀菌[1]。化学防腐剂能在一定程度上抑制微生物的活动，一旦剂量超标，不仅对食品的品质造成较大的影响，同时严重危害了人体的健康[2]。因此，人们寻求新型非热杀菌技术。近几年来，冷等离子体（cold plasma，CP）作为一种新型冷杀菌技术，正逐步受到全球食品研究者的关注，其具备一种理想杀菌法所应具备的全部优点，如杀菌全面，真菌类型病原菌、抗性细菌细胞、抗辐射细菌、酵母菌、芽孢和病毒等在冷等离子体的处理下都能有效杀灭[3]；能够将食品营养成分的损失和感官特性的变化降低到最小；无有毒副物的生成；不会对操作者造成伤害。该文综述了冷等离子体的杀菌机理、食品表面及包装材料的杀菌、净化废水、表面去污等领域应用研究现状，为冷等离子体技术在食品工业中的广泛应用提供参考。

1 等离子体的概念

等离子体是由各种带电粒子（如电子、离子、中性粒子、活性自由基、射线）组成的电离气体，这些带电粒子拥有足够高的能量能够激发相应的化学反应[4-7]。由于正电荷总数和负电荷总数在数值上相等，故称其为等离子体，是继“固相、液相、气相”以外的第四态物质。等离子体主要存在于自然界中，也可以通过人工方式获得。目前实验室主要用介质阻挡放电、滑动电弧放电、电晕放电、火花放电、辉光放电等发生装置产生等离子体。等离子体通常是气体在强电磁场或加热条件下电离产生，当温度达到几千摄氏度或更高时，荷电粒子会发生加速运动，由于电子相对较轻，被加速的通常是电子，高能电子与重粒子（原子、分子、离子）相互间的激烈碰撞使气体分子发生电离，最终形成等离子体。

根据带电粒子中电子、离子和中性粒子温度的相对高低，等离子体可以分为高温等离子体和低温等离子体。高温等离子体中带电粒子温度一般可达108～109℃。低温等离子体又可根据带电粒子中的电子、离子、中性粒子是否达到热力学平衡状态，分为热等离子体（热平衡等离子体）和冷等离子体（非热平衡等离子体）。在热等离子体中，电子的温度与离子和中性粒子的温度几乎相同。而在冷等离子体中，当对气体施加脉冲电场时，电子、离子和中性粒子会发生弹性碰撞，导致一部分动能转移重新分配到其他粒子上，储存在自由电子的温度达到104℃远高于离子和中性粒子的温度，中性粒子和离子的温度仅接近室温，从而使得冷等离子体能够保持较低的温度条件[7-10]。另一方面，当非弹性碰撞的能量超过15 eV时，能够发生各种离子体化学反应，如激发、电离等[9]。这些反应所产生的活性种（reactive species，RS）如活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮（reactive nitrogen species，RNS）、带电粒子、电子和紫外线/真空紫外线等都对微生物的失活起着至关重要的作用[9-10]。

2 冷等离子体杀菌机理

冷等离子体作为一种新型的非热杀菌技术，在食品杀菌方面的应用研究还处于起步阶段，关于其杀菌机理还不甚明了。一般认为冷等离子体起杀菌作用主要为超氧化物、羟基自由基、过氧化氢、一氧化氮和臭氧等活性物质和带电粒子，其作用位点为细胞膜和胞内遗传物质[11-14]。活性氧和活性氮类化合物能够与细胞大分子物质如蛋白质、脂类、酶以及脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）发生潜在的反应以改变生物膜的功能特性，扰乱细胞正常的生理功能从而导致细胞死亡[15]。DOLEZALOVA E等[16]认为一些活性氧化物能够穿过细胞外膜进入细胞内，并且对DNA和蛋白质造成氧化损伤，间接杀死微生物从而达到杀菌效果。MAI-PROCHNOWA等[17]用大气冷等离子体对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）进行杀菌处理，发现臭氧是引起生物细胞膜破裂的关键因素。臭氧通过物理腐蚀细胞膜增加了细胞膜的通透性，从而诱导DNA发生氧化应激反应，引起内容物质流出导致细菌溶解死亡。FERNANDEZ A等[18]以大肠杆菌为研究对象发现，带电粒子可以在细胞膜表面聚积，电荷的聚积使得细胞膜表面的张力远小于产生的静电力从而使细胞发生裂解导致微生物的死亡。除活性物质和带电粒子外，紫外线也可以损伤微生物DNA内部的分子结构，波长在250～500 nm的紫外线不但可以抑制细胞DNA中胸腺嘧啶的合成，同时还可以阻碍细胞增殖和自我复制功能，对细胞的生物大分子结构造成破坏，使蛋白质失去原有的生物学活性[19]。

3 冷等离子体杀菌效果的影响因素

冷等离子体的杀菌效果受到多种因素的影响，如冷等离子体发生设备的相关参数（冷等离子体产生设备的类型、激发电压、电离气体等）、微生物的固有特性（种类、生长环境）和食品的基本性质（食品成分、状态）。

3.1 冷等离子体设备的相关参数

激发介质中所使用的气体决定了放电过程中产生的活性带电粒子的类型和数量。HURY S等[20]分别以氩气和氧气为激发介质对芽孢杆菌（Bacillus）进行杀菌处理，发现氧基冷等离子体具有更高的杀菌效果。通常使用混合气体激发冷等离子体比单一气体杀菌效果更好，XU L等[21]在橙汁中接种肠道沙门氏菌（Salmonella），分别在空气袋中和气调包装（modified atmosphere packaging，MAP）（65%O2+30%N2+5%CO2））袋中用高压大气冷等离子体（high voltage atmospheric cold plasma，HVACP）直接对橙汁进行杀菌处理，经过2 min处理后发现空气袋和MAP袋中橙汁的肠道沙门氏菌（Salmonella）分别减少了0.65 lg（CFU/g）和1.75 lg（CFU/g）。处理完储存24 h，发现肠道沙门氏菌群体持续减少，空气袋中和MAP袋中分别减少了2.81 lg（CFU/g）和5 lg（CFU/g），这表明HVACP产生的活性带电粒子在断电后依旧能够保留在包装袋内，与传统杀菌技术相比能够节约大量的能源，MAP气体相对空气来说对橙汁中肠道沙门氏菌的灭菌效果更好，这是由于不同气体与HVACP相互作用产生不同的活性带电粒子有关。同时，产生的活性物质数量与输入电压的功率和频率也密切相关，杀菌的效果与电压功率的增加成正相关[22]。张梅等[23]研究发现，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在50 W功率条件下若需全部灭活需要60 min，而在200 W功率条件下仅仅只需要5 min即可全部灭活。

3.2 微生物的固有特性

微生物的种类、生长环境也是影响杀菌效果的重要因素。稳定期的细菌比对数期的细菌对杀菌处理更敏感[24]。孢子状细菌比营养细胞更耐等离子体处理，浓度越高的细菌杀菌效果越弱，这主要是因为高浓度的细菌能够聚集更多细胞，降低了活性物质的穿透力，阻碍了活性物质与微生物的相互作用[25]。细胞壁的厚度也是影响冷等离子体杀菌效果的一个重要因素，冷等离子体对革兰氏阴性的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和革兰氏阳性的单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的杀菌效果存在显著的差异，结果表明单核细胞增生李斯特氏菌的抗性较强，这是因为革兰氏阳性细菌细胞壁的厚度约为15～18 nm，而革兰氏阴性细菌的细胞壁厚度仅为2 nm，细胞壁越厚使得活性氧物质及带电粒子穿透或击破细胞壁所需要的时间就越长[26]。

3.3 食品的基本性质

食品组成成分、pH值、相对湿度等都能够影响冷等离子体的杀菌效果。相比于液态食品，冷等离子体对固态食品的杀菌效果更好，这可能是因为液态食品中的水分和食品基质减弱了活性带电粒子的穿透能力。此外，相对较低的pH值也能够增强冷等离子体的杀菌效果，如MURANYI P等[27]发现，蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）经冷等离子体杀菌处理后，菌落总数在pH 7时减少了2.1 lg（CFU/g），而在pH 5时减少了4.7 lg（CFU/g）。同样，相对湿度的增加能够增加羟基自由基的数量导致更过微生物失活，提高了冷等离子体的杀菌效果。

4 冷等离子体在食品杀菌中的应用

4.1 冷等离子体在食品表面的应用

随着消费者对食品安全的高度重视，一时之间食品工业面临着既要为消费者提供营养、安全和货架期稳定的食品，又要防止微生物污染的艰巨挑战。在生产加工和采收过程中，微生物的入侵可以发生在任意环节，包括运输、人工处理、设备操作、车间卫生等。而对于一些特殊产品如：乳制品的质量安全问题一直以来都受到大家的高度重视，由于其营养价值高，一直以来都深受大家的喜欢。采用传统的热杀菌方法不仅会使其口感大打折扣，同时造成大量营养物质流失。因此涌现出了许多非热杀菌技术，如脉冲电场（pulsed electric fields，PEF），高压处理（high pressure processing，HPP）、辐射和冷等离子体等。冷等离子体作为一种非热杀菌技术具有高效、低温、无残留、破坏性小等优点，在满足人们对食品品质需求的同时也可以保证食品的安全。从一些初步研究可以看出冷等离子体能够有效地杀灭果蔬类食品表面、液体食品、肉制品等生产加工和储存过程中所产生的有害微生物。ZIUZINA D等[28]用冷等离子体分别对圣女果处理10 s、60 s、120 s后发现其表面的沙门氏菌（Salmonella）、大肠杆菌（Escherichia coli）、单细胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）分别从初始菌落的3.1 lg（CFU/g）、6.3 lg（CFU/g）和6.7 lg（CFU/g）减少至检测限。

液体食品由于其特殊的产品属性，能够为微生物提供良好的生存环境，在储藏过程中极易被微生物入侵，对食品的品质和风味造成较大的影响。因此，杀菌处理是液态食品必不可少的一个环节。将冷等离子体杀菌技术应用于液体食品，是一项巨大的突破。因为冷等离子体是气体受到外界高能量（强电磁场、高温等）放电而产生的，如果液体中没有足够多的气体，很难激发冷等离子体，因此如何将大量的气体成功地引入到液体中是实现杀菌的关键因素。MA H等[29]将空气和纯氧以气泡的形式引入液体中，并将电场施加于液体与气体气泡的混合态上成功的灭活了牛奶和橘汁中的沙门氏菌和大肠杆菌O157：H7。

研究证实经冷等离子体处理后不会对其品质造成太大的影响。乔维维等[30]研究了低温等离子体对牛肉的最佳杀菌效果以及杀菌处理后对其色泽的影响，研究表明牛肉的α*值（红度）与电压的大小和处理时间有很大的关系；在72 kV的电压下使用30%N2、35%O2和35%NO2混合气体为激发介质的低温等离子体对生鲜牛肉表面的细菌进行杀菌处理86 s后，其表面细菌残留量大幅度减少，杀菌率可达到93.75%，并且能够使牛肉保持较好的色泽和风味。此外，经冷等离子体处理后不仅能够杀灭微生物，而且能够改变食品中内源酶的活性。在一定程度上能够有效地抑制鲜切果蔬、糙米等食品中的α-淀粉酶、多酚氧化酶、果胶甲酯酶、过氧化物酶等内源酶的活性，起到延缓果蔬酶促褐变、谷物陈化的作用[31]。LEE K H等[32]研究发现，糙米经冷等离子体处理后其表面的蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌从初始浓度的4.29 lg（CFU/g）和4.23 lg（CFU/g）分别降低到1.30 lg（CFU/g）和1.29 lg（CFU/g），同时糙米的水分吸收率和α-淀粉酶的活性得到有效地提高。这可能是因为冷等离子体产生的活性物质导致米糠层出现裂痕改变了其内部的构型，使得糙米的吸水性，酶活性发生了变化[33]。

4.2 食品包装材料的灭菌

对食品原材料进行包装处理能够适当延长保质期，防止其在运输和储存的过程中发生腐烂变质。如果处理不当，可能导致包装材料被微生物入侵间接污染食品原材料引起腐败变质[34]。研究证实包装材料经冷等离子体处理后能够有效地灭活其表面的微生物，并且对某些包装材料还有增强效果。OHYA等[35]用脱脂豆粕（defatted soybean meal，DSM）制成的可食性薄膜覆盖于烟熏鲑鱼上，在400 W经冷等离子体处理15 min后发现DSM膜的水分阻隔性、伸长率分别增加了24.4%、13.4%。冷等离子体还能够有效地延长包装材料的密封性功能[36]。并且在聚合物表面沉积阻挡层如抗菌剂、抗氧化物等物质，减少气体（氧气和二氧化碳）渗透到包装材料中有效地避免微生物入侵。

4.3 净化废水

在绝大多数食品企业需要消耗大量的水以满足日常需求，大部分水主要用于设备以及原材料的清洗。水被高负荷的腐生病原微生物和有机化合物污染后如果处理不当容易对土壤造成污染最终引起食品原材料的变异。由于食品加工厂排放的废水含有很高的有机负荷，采用传统的物理化学方法很难完全净化废水。有研究表明当活性氧化物质扩散到废水中时能够有效地分解或降解污染物。MOHAMED A A H等[37]已证实，水果和蔬菜加工厂排放的废水经冷等离子体处理后能够实现有效净化，在此次研究中采用一台25 kV的等离子体射流对西红柿、黑莓和甜菜根加工厂排放的废水进行处理，结果表明西红柿加工厂排放的废水经等离子体处理150 s后已完全净化，黑莓和甜菜根排放的废水经处理180 s后废水细菌数量分别减少了0.411g（CFU/g）和2.24 lg（CFU/g），并且处理后的废水化学需氧量减少了57.5%～93.3%，废水中的内毒素减少了90.22%。冷等离子体净化废水的原理主要是因为羟基自由基以及其他活性物质扩散到废水表面引起有机化合物的降解，在降解的过程中伴随着紫外线光波的作用由于冲击波的感应间接引起热解和化学反应从而起到净化废水的作用[38]。

4.4 设备表面去污

通常除食品自身携带的病原微生物外，在加工运输操作的过程中处理设备的表面也会被微生物污染，并且微生物容易在自然条件下产生多聚物基质薄膜黏附于设备表面，由沙门氏菌形成的生物膜化学耐受性较好难以从设备表面去除。这些病原微生物能够在食品加工设备、输送带和不锈钢设备表面形成生物薄膜这对于酿造业、乳制品加工和家禽加工行业一直以来都是一个很严重的安全隐患问题。研究表明，不锈钢设备经过冷等离子体处理后能够引起表面的蛋白质发生变性[39]。LEIPOLD F等[40]采用介质阻挡放电等离子体对一个旋转的切肉刀片进行去污处理，当将李斯特菌接种到刀片上后经冷等离子体处理340 s后，发现李斯特氏菌减少了5 lg（CFU/g），并且该方法允许刀片在工作的同时进行去污处理，能够有效地降低肉与刀片之间二次污染的风险。最近，JACOFSKY M C等[41]发明了一项专利描述了多频谐波富集的冷等离子体对食品接触表面和食品输送带的灭菌，该专利的原理主要是对食品的有效区域以及特定时间段的食品进行冷等离子体处理从而达到灭菌的效果。

5 展望

冷等离子体作为一种快速有效的非热杀菌技术，对果蔬表面杀菌、延长液态食品货架期、防止肉制品腐败变质等食品安全与营养控制领域展现出良好的发展前景，并且该技术还具有净化设备表面污渍，降解废水中有机污染物等作用。目前看起来是一种安全、环保可靠并且能够替代传统热处理的有效方法。因此，为了进一步加快冷等离子体在食品工业中的应用今后的研究和发展重点主要放在以下几个方面：①能够引起冷等离子体起杀菌作用的反应物很多，是否存在除超氧化物、臭氧等活性物质以外的反应物也具有杀菌能力需要我们进一步探究；②经冷等离子体处理后引起食品性质改变的研究还不是很彻底，有关安全方面的问题，需要进一步做毒理性试验以确保其安全无害；③将多种冷杀菌技术联合使用，增强杀菌效果，更好地解决食品易腐败变质的问题；④将冷等离子体拓展到更多交叉领域中，充分发挥其优点，实现应用的最大化。