合肥地区春季茶园真菌区系的初步研究

徐莹梅，俞 静

(安徽林业职业技术学院，安徽 安肥 230031)

1 引言

微生物是一类肉眼不可见的微小生物的总称，其中包括病毒、蓝细菌、细菌、放线菌、粘菌、霉菌、藻类和原生动物等[1]。它们种类庞杂，姿态万千，相互作用也错综复杂。茶园是以茶树为主要栽培对象的经济灌木园,园中不同空间部位栖居有不同的真菌群落,病害真菌也是此真菌群落的重要成员[2]。从茶园的真菌群落进行调查研究,弄清茶园真菌种类,这对于探索茶园病害发生机理及微生态防治措施具有重要意义[3]。茶园属于一个小的生态环境，因此微生物在茶园里分布极为广泛，有些微生物能引起茶树的病害，在这一方面，已有工作者的调查研究，并有效地开展防治工作。但是为什么在同一块茶园里，有些叶片几乎是处于同一生态环境下，有的发病，有的却不发病。是不是因为在这些茶树叶面有抵制有害微生物的有益微生物呢？目前，这一方面的研究工作做的不多，因此笔者对茶园叶面微生物区系做了部分研究工作，主要研究了真菌的分离和鉴定。

2 材料和方法

2.1 材料

打孔器(Φ为0.8 mm)；CHA-S振荡器(农业部重点实验室提供)；马铃薯葡萄糖琼脂培养基；灭菌培养皿6套、灭菌吸管2支(2 mL、三角玻璃涂棒；无菌水2瓶(250 mL三角瓶装100 mL)；显微镜。

2.2 方法

2.2.1 采样

于2017年3月17日，在安农大茶园用五点采样法采摘中、上部叶各五片，供分离用。

2.2.2 玻璃器皿的灭菌

将需用的培养皿、三角玻棒、吸管(2 mL)洗净、晾干、包装就绪后，放入烘箱中加热至160 ℃,处理1 h。

2.2.3 固体培养基的配制

取200 g去皮新鲜马铃薯切碎，加水100 mL煮沸0.5 h,用纱布滤去马铃薯，加水补足100 mL,然后加20 g葡萄糖、20 g琼脂。加热使琼脂完全熔化后，乘热用纱布过滤，而后分装三角瓶、试管(每支约10 mL)，同时将2瓶装有200 mL水的三角瓶一起放入高压灭菌器中，在15磅蒸汽压下处理25 min,待用。

2.2.4 菌液配制

把采摘的叶片以小水流冲净、晾干，用打孔器取20个圆形叶片(为0.8 mm)并投入无菌水三角瓶中，随后分别在两瓶上作“上”、“中”标记并放入CHA-S型振荡器中在20 ℃温度下高速振摇1 h,以使真菌的孢子分散。取6套培养皿，分别在皿底外面编号上1、上2、上3、中1中2中3，然后将熔化后的培养基冷却至45 ℃左右时，分别以无菌操作的方法倾入已编号的培养皿中，凝固待用。在无菌室中用吸管分别吸取2 mL菌液移入其相应编号的培养基上，并用三角涂棒轻轻涂匀(注意：三角涂棒每次使用前要在火焰上灭菌)几个处理的操作完毕后，将培养皿倒置于26 ℃恒温箱中培养。3 d后，用肉眼观察菌落 的生长情况，7 d后用显微镜检察各菌落菌丝和子实体(分生孢子梗、分生孢子)的情况，并对此进行鉴定，一般仅鉴定到属。所鉴定的真菌均移至斜面培养基上进行菌种保存。

3 结果与分析

3.1 分离的真菌种类及性状描述

链格孢属(Alternaria) 孢子梗不分枝，长短不一，分生孢子暗色，有纵横分隔，长卵形，成串形，成链形。

曲霉属(Aspergillus) 菌丝有隔，无色，分生孢子梗无隔，顶端膨大呈球形，球形表面长出小梗，小梗有分枝，顶端串生分生孢子，圆球形。

尾孢属(Cercosporasp) 分生孢子梗不分枝，略弯曲，黄褐色，分生孢子鞭状，基部较粗，顶端渐系细，有5～9个分隔，且分隔明显[5]。

头孢属(Cephalosporium)菌丝上长出的分生孢子梗直立短小，顶端着生球形的分生孢子，单胞无色，并由分泌物粘在一起形成球状。

枝孢属(Cladosporium)孢梗橄榄色，近端或中部分枝，分生孢子褐绿色，单胞或双胞，卵圆形。

镰孢属(Fusarium)分生孢子梗单生，分生孢子多细胞，镰刀形，两端形尖，弯曲显著。培养基中产生大量的气生菌丝，呈絮状。菌丝到后期呈黄色。

长孺孢属(Helminthosporiuim) 孢子梗较长，暗色有横隔，稍弯曲，分生孢子亦有隔，椭圆形。

大茎点属(Macrophoma) 孢子梗单生，短而细，分生孢子单胞，无色，卵圆形。

青霉属(Penicillium) 菌落墨绿色，分生孢子梗从菌丝上垂直生出，端生帚状分枝，顶生小梗，小梗上着生链状的分生孢子，单胞，卵圆形，数量非常多。

拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis) 分生孢子四分隔5细胞，中间3胞黄褐色，两端细胞无色，顶端有2～3根附属丝。

茶叶点霉(Phyllostictatheaefolia) 分生孢子器球形，分生孢子无色，微小，单胞，卵形。

白色不产孢丝状真菌，白色菌丝，絮状，不产孢(表1)。

3.2 分离密度和分离相对频率

分离密度=(平均菌落数×(1 mL/0.2 mL)×100 mL)/(0.42π×20×2)(面)

相对分离频率=(各菌分离的菌落数/总菌落数) ×100%

表1 春季菜园真菌种群趋势

4 春季茶园真菌种群趋势简析

由表1中的数据可知，3月中下旬从茶树叶面上分离到的真菌有尾孢属、青霉属和拟盘多毛孢属等6种真菌，其中尾孢属、青霉属真菌分离的相对频率较高，密度也较大，它们分别为66%、6101.6cfu/cm2和 24%、2211.2cfu/cm2；至4月下旬，尾孢属和青霉属的出现频率、分离密度都有一定程度的提高 ，分别达70.4%、6257.8cfu/cm2和33.7%、2992.2cfu/cm2,白色絮状真菌、链格孢属的频率和密度亦有一定的提高，同时，4月下旬又分离到叶点霉属，枝孢属和大茎点属三类真菌，3月份出现的头孢属和拟盘多毛孢属这次又未分离到，这些情况的出现，表明春季茶园随着温度、湿度和其它生态环境的变化，真菌微生物不仅在数量上会发生变化，而且在种类上也会发生较大的变化，从5月上旬分离到的9个属的真菌来看，这种情况表现得更加明显，首先链格孢属、白色絮状真菌、青霉属出现的频率和密度均大幅度下降，同时又出现了几类新的真菌，如长孺孢属、镰孢属、曲霉属等，特别是曲霉属刚一出现就有较高的分离频率和密度，为21%和1604cfu/cm2,此时的叶点霉属已升至最高。

从总的趋势来看，春季茶园的叶面真菌微生物种类较多，有的从3～5月份不仅始终能分离到，且种群数量能维持在较高的水平上，如青霉属、链格孢属、白色絮状菌丝等，种类上也有一定的变化，3月份仅分离到6种，5月份分离到9种，出现了长孺孢属、镰孢属、曲霉属等。在这些分离到的真菌属中，有的包括着茶树的病后菌如叶点霉属就包含着茶树上3种病原物(茶芽枯病菌、茶白星病菌、茶赤叶斑病菌)；尾孢属(茶褐色叶斑病菌)，拟盘多毛孢属(茶轮斑病菌)等，这些真菌如出现的频率高，密度大，就预示着有病害流行的可能，还有一些属的真菌的出现并非是茶树叶片病原物，如：青霉属、头孢属、曲霉属等。它们既然在茶树叶面上出现，且密度较大，必然有它存在的生态意义，它们于一定时间内在叶面上占据一定的空间位置，可能对病原菌具有一定的抑制作用，这些均有待进一步的研究。

5 结语

本实验是于3～5月间进行的，时间较短，仅对春季茶园内真菌种群做了大致的了解，并不全面，这项工作应继续进行下去，摸清茶园内全年种群数量及分布特点，对于维护茶园生态平衡和有害生物的综合治理必将产生深远的影响。