筛选菌株S1产海藻酸钠裂解酶最优条件及其 裂解海藻多糖条件的优化

韩新月　陈营

寻找菌株S1发酵海带时海藻酸钠裂解酶活力较高的条件，将海藻酸钠裂解酶提取并将其接入在不同条件的培养基中，选出能够裂解海藻多糖和使海带液化的最佳条件。

方法  用酶活检测的方法检测出菌株S1在何时产生海藻酸钠裂解酶活力最强;在235nm下检测海带发酵液中海藻寡糖的含量。

结果 海带分解75%时海藻酸钠裂解酶活力为8.5，内装有氯化钠、维氏盐、氯化铵、30%海带的三角瓶中且温度为37℃在160rpm下一直摇动海带在三天内液化85%。海带分解75%时海藻酸钠裂解酶活力较高，在此时提取的海藻酸钠裂解酶接入内装有氯化钠、维氏盐、氯化铵、30%海带的三角瓶中且温度为37℃在160rpm下一直摇动海带液化速度最快且产生海藻寡糖的量最多。

随着科技的进步，研究发现海藻寡糖在食品、日用化工、化妆品、医药、军工、农业等领域具有重要意义。如海藻糖可以代替蔗糖用于食品领域，海藻糖与蔗糖相比甜味更为平和，使血糖升高的速度也更为缓慢，海藻寡糖也可以添加到海藻面膜等化妆品中具有良好的保湿效果，在军工领域海藻寡糖可用于防辐射止血，是天然的好材料，在医药领域海藻寡糖可以用于保存生物制剂维持生物大分子的活性，还可以附着在细胞表面维持细胞的活性，在农业领域海藻寡糖可以作为植物生长的营养液使植物具有独特的生长优势。获得海藻寡糖方法主要有物理降解法、化学降解法以及生物降解法。物理法主要采取辐射的方式，操作复杂且降解条件难以控制;化学法目前采用，但存在目标寡糖的产量少，副产物多及回收率低等问题;微生物发酵法条件温和，成本低、操作简单，但菌种易污染，微生物利用有益产物导致产量降低。酶特异性降解法具有专一性强、寡糖得率高且条件温和等优点，目前已报道的海藻寡糖裂解酶可以很快将海藻多糖裂解且得到大量海藻寡糖，因此提取海藻寡糖裂解酶及其作用条件有很大研究价值。本实验从海带发酵液中通过酶活检测找到S1菌何时产生海藻酸钠裂解酶的酶活最强，并通过微孔滤膜注射器分离出海藻酸钠裂解酶，并将海藻酸钠裂解酶应用在不同条件的以海带为底物的培养基中，挑选出最适合海藻酸钠裂解酶作用的条件，目的是最大程度地提取和利用以寡糖为主的海带有效成分。

一、材料与方法

1、 材料

（1）样品  采于山东烟台长岛县海带养殖场的新鲜海带。

（2）实验菌种

S1为得到一株能够裂解海藻多糖的菌株，我们可以从腐烂的海藻如海带中寻找，挑取腐烂的海藻在以海藻酸钠为唯一碳源的选择培养基中培养平板划线分离，挑取单菌落接种至另一个相同的培养基中平板划线，取单菌落接种至海带富集培养基中，若其能使海带液化，则证明其为所需要的菌株，然后对其进行16SrRNA鉴定。

（3）培养基  富集培养基（g/L）：新鲜海带块（1 cm2以下）300 g，硫酸铵5 g，氯化钠10 g，维氏盐溶液50 mL，pH 6-7（维氏盐溶液：K2HPO4·3H2O 6.50 g，MgSO4·7H2O 2.50 g，NaCl 2.50 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4·H2O 0.04 g，蒸馏水1000 mL）。

（3）实验方法

①海藻酸钠裂解酶的制备方法

干海带浸泡四个小时后将海带切成细小的碎块，放入500ml三角瓶中，每瓶加入30g海带碎块、100ml富集培养基，即海带浓度为30%。高压蒸汽灭菌（121℃，30min），取冰箱里保存的海带发酵液按10%接种量接入富集培养基，设置两组平行实验和一组空白实验。将接种后的富集培养基放入摇床（温度：37℃、转速：160rpm）摇瓶培养。与对照组对比，觀察海带分解程度，并在海带分解50%、75%、100%、100%放置一天、两天时，分别取发酵液经5000rpm离心10min后，将上清液经过微孔滤膜注射器过滤除菌后即可制成海藻酸钠裂解酶粗酶提取液。

②海藻酸钠裂解酶酶活性及海藻寡糖的含量的检测方法

检测海藻寡糖含量的具体方法：取4ml发酵液，在500r/min的离心速下，离心10-15min，然后取1ml上清液液适当稀释，在235nm处测量其光吸收值，以此值乘上稀释倍数来代表1ml发酵液中海藻寡糖的含量。

检测海藻酸钠裂解酶活性的具体方法：取4ml发酵液，在500r/min的离心速下，离心10-15min，然后取1ml上清液液适当稀释，测量稀释后上清液在235nm下OD值然后把稀释的上清液在40℃水浴中加热10min，再迅速煮沸15min使酶灭活，再次测量235nm下的OD值。规定：40℃水浴加热10 min，吸光值增加0.1为一个酶活力单位U。测量前后两次OD值的差值再乘以稀释倍数最后除以0.1即为1ml发酵液或反应液的酶活。公式表达为：1ml发酵液的酶活=[（OD值后-OD值前）·稀释倍数]/0.1

③不同发酵产酶时间对酶解反应的影响

将所制得的酶液按照10%接入量，接入内装有100ml富集培养基的500ml的三角瓶中。将接入酶液后的富集培养基放入摇床（温度：37℃、转速：160rpm）摇瓶培养，进行酶解反应使海带分解，每隔一天测量一次各组反应液中的酶活及海藻寡糖的含量并且观察海带分解情况，一共培养四天。将海带分解情况拍照记录并记录跟踪检测的数据，最后选出海带分解情况最好的一组，由此即可确定哪一海带分解度时所制得的酶液为使海带分解的最适酶液。

④体系不同成分对酶解反应的影响

海藻酸钠裂解酶粗酶提取液与海带的酶解反应过程中，培养基中的氯化铵、酵母浸膏、海藻酸钠与细菌生长有关，氯化铵和酵母浸膏中的成分是否影响酶解反应未知。海藻酸钠裂解酶活性的发挥需要离子为已知。在含有离子（氯化钠和维氏盐）的几组培养基中分别加入酵母膏、硫酸铵、酵母膏和硫酸铵并设置纯水对照组，制取海带发酵分解75%时的海藻酸钠裂解酶粗酶提取液进行实验，摇瓶（温度：37℃、转速：160rpm）培养三天后观察各组海带分解情况并测量各组中的酶活和海藻寡糖含量。

⑤不同温度与摇动时间对酶解反应的影响

将实验温度设置为42℃，设置42℃静置、42℃分段摇动、42℃一直摇动三个实验组。由于实验室条件所限，对照组选择为1.2.3中的最优组，酶解反应体系成分均采用1.2.3中最优组成分。培养三天后观察海带分解度及测定酶活性和海藻寡糖含量。比较数据得出结论找到工艺优化的最适温度和体系摇动时间。

⑥不同海带浓度对酶解反应的影响

进行实验来探究最佳海带浓度。选择已经探索并得出结论的最优实验条件，从起始30%海带做起，到40%、50%、60%、70%，并设置平行组，最后只看分解效果和测量235nm的OD值。按海带量的10%接入酶液。放置最优条件下培养三天，观察各组海带分解程度。

二、结  果

1、发酵产酶的最佳时间

将海带达到各个分解度的发酵液过滤除菌制得无菌的海藻酸钠裂解酶粗酶提取液，将海藻酸钠裂解酶粗酶提取液按10%的接入量加入到灭菌后的海带培养基中摇瓶培养4天，每隔一天检测一次酶活及海藻寡糖的含量并观察记录分解情况。

2、 酶解反应体系的最佳成分

酶解反应体系中的最佳成分是离子（氯化钠和维氏盐）和氯化铵，它们的存在可以促进海带的分解，有利于酶解反应。取各组的反应液离心取上清液检测反应液中的酶活性及海藻寡糖的含量 ，如表2

3、酶解反应的最适温度与摇动时

反应体系成分：海带、氯化钠、维氏盐、氯化铵、酶液

分段摇动为每天定时摇动2h

4、酶解反应的最佳海带浓度

最优实验条件：温度：37℃，160r/min，酶促体系成分为氯化钠、维氏盐、氯化铵，从起始30%海带做起，到40%、50%、60%、70%，设两个平行，最后只看分解效果和测量235nm的光吸收值，按海带量的10%接入酶液。

三、讨论

1、发酵工艺优化分析  在进行传统的发酵方法制备海藻寡糖时，我们发现发酵液中海藻寡糖的含量是先上升后下降的，在海帶完全液化分解之时，发酵液中海藻寡糖的含量并非最高。我们的研究目的有两个，一是尽快使海带完全分解液化，二是使发酵液中海藻寡糖最高。但由于微生物在分解海藻酸产生海藻寡糖之时也会利用海藻寡糖，所以为了得到尽可能多的海藻寡糖，我们将传统的发酵法工艺进行优化。优化分为两个阶段，第一阶段是海带发酵阶段，此阶段的主要目的是制备酶活性最高的无菌海藻酸裂解酶粗酶提取酶液，第二阶段的主要目的是利用所制得的酶液使海带分解产生海藻寡糖。由于第二阶段的反应体系中没有菌体细胞存在，因此只要酶的活性足够，在底物充足的情况下便会一直积累产生海藻寡糖而无消耗，这样便可达到工艺优化提高产量的目的。

2、小结  本次研究收获的是已经掌握了制备无菌酶液的方法即微孔滤膜除菌法，目前可以制得纯净的无菌酶液。找到了一种测量酶活及海藻寡糖含量的简便有效的方法，即以发酵液自身来测酶活，测定235nm下的OD值。探索出了海带发酵分解至75%这一分解度时所制得的粗酶液能够使固体海带以最快的速度分解且分解效果彻底。探索出了工艺优化的最佳条件。更为重要的是提高了海藻寡糖的产量，在相同条件下利用工艺优化的方法生产海藻寡糖比传统菌种发酵的方法产量提高了25%。

（作者单位：264005烟台大学生命科学学院）