β样淀粉蛋白和早老素增强子-2与环磷酸腺苷应答原件结合蛋白的关系

邸畅 李国萍 陈绍春，3

(昆明医科大学 1基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，云南 昆明 650500；2第三附属医院头颈外科；3康复学院)

β淀粉样蛋白(Aβ)沉积是阿尔茨海默病(AD)公认的一个病理学改变也是诊断依据之一。γ分泌酶是产生Aβ的最后剪切蛋白复合体，它剪切生成的Aβ主要为Aβ40和Aβ42。而比较认可的形成Aβ沉积的原因就是Aβ40和Aβ42比例的失调。γ分泌酶中起主要催化作用的部分是早老素(PS)-1，而早老素增强子(Pen)-2主要作用就是使PS-1内分解，对底物的催化作用产生影响。环磷酸腺苷应答原件结合蛋白(CREB)是与长期记忆和基因转录密切相关的一种蛋白，单体Aβ42可以促进其生成，而CREB本身可以调节Pen-2表达。本文就Aβ的形成意义、CREB的前后作用、Pen-2的功能对三者间的关系进行综述。

1 Aβ的形成

淀粉样前体蛋白(APP)在经过β分泌酶切割的情况下形成99个氨基酸的肽链(C99),C99在γ分泌酶剪切后形成Aβ40和Aβ42，Aβ40和Aβ42的区别在于Aβ42羧基端多了2个疏水键，导致Aβ42更容易积聚沉积形成淀粉样斑块〔1〕。在脑中形成的Aβ斑块会对神经元产生毒性作用导致神经损伤甚至脑萎缩，而Aβ寡聚体很可能是淀粉样斑块的前体〔2〕。Aβ寡聚体可能通过降低CREB靶基因和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达而损害AD中的神经元功能。恰恰相反的是新的研究发现Aβ42单体可通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路诱导分化型人神精母细胞瘤和元代大鼠皮层神经中CREB的激活,而Aβ42寡聚体没有这个影响,反而在大鼠模型和AD患者中CREB的表达受损〔3〕。这说明单体和寡聚体之间的转变是毒性作用产生的原因。Aβ40与Aβ42的比例失常被认为是导致淀粉样沉淀的原因，Aβ40在AD发病机制中具有保护作用。虽然已知Aβ40能抑制Aβ42纤维的形成，但尚不清楚这种抑制作用是对无毒单体起作用，还是对毒性寡聚体起作用。有研究通过核磁信号来监测Aβ42和Aβ40单体的变化，差异核磁共振同位素标记可以选择性地观察Aβ42在Aβ42和Aβ40混合物中的聚集状况〔4〕。Aβ40单体通过Aβ42/Aβ40比例依赖的方式抑制无毒Aβ42单体的聚集。核磁共振测定表明，Aβ40单体与Aβ42寡聚体的结合比Aβ42单体具有更高的亲和力。Aβ40还可以从Aβ42寡聚体中释放Aβ42单体〔4〕。另有研究发现，构成纤维的Aβ分子不断地解离和再结合，从而导致纤维群内的分子循环〔2〕。对Aβ40和Aβ42的研究表明，构成Aβ40的分子比Aβ42的再循环程度要大得多〔2〕。这在侧面也说明了Aβ40在与Aβ42的作用中起到一个保护Aβ42不聚集沉积的作用，当这种比例失调发生的时候单体Aβ40的量不能维持可以使单体Aβ42游离的程度，Aβ的寡聚体就形成了，而恶性循环下毒性斑块的形成也只是时间问题。Aβ42有4种形态，分别为单体、寡聚体、原纤维和纤维，其中Aβ42单体和纤维是没有神经毒性的，寡聚体的毒性最大，原纤维的毒性反而降低〔5〕。在过去的研究中有针对小胶质细胞和星形胶质细胞对Aβ寡聚体吞噬的研究，笔者推断正常情况下当Aβ42寡聚体形成过多时被小胶质细胞和星形胶质细胞吞噬是正常的代谢过程。而上述的胶质细胞对纤维的吞噬能力比对寡聚体的吞噬能力弱得多，即当Aβ寡聚体形成过量而无法代谢时，沉淀形成斑块的可能性将大幅增加。

2 CREB

CREB在大脑中的所有细胞中都有表达，CREB最著名的是它参与学习和长期记忆的形成，是作为转录因子发挥作用的蛋白质家族中的一员。转录因子(如CREB)对刺激转录耦联起着至关重要的作用。将发生在细胞膜上的事件传递给基因表达的改变。反过来，改变基因表达，通过调节几乎所有类型的神经元蛋白的表达，最终会影响单个神经元和整个神经元回路的功能。CREB介导的基因转录的关键步骤包括二聚，与DNA中的反应元件结合及磷酸化。近年来的研究表明，老年人非病理性记忆障碍与信号转导异常有关〔6〕。CREB转录因子家族的成员包括转录增强子(如CREB1)和抑制子(如CREB2)，并与许多信号蛋白相互作用，介导从短期记忆到长期记忆的转变。用定量Western印迹法测定6月龄和24月龄大鼠海马匀浆中CREB1和CREB2的含量，根据空间记忆能力，将老年大鼠分为两组：年龄无损伤大鼠(AU)在青年(Y)得分的范围内，而老年受损大鼠(AI)的范围内得分不在该范围〔6〕。总体而言，老年大鼠CREB1蛋白明显低于青年大鼠。实验分析表明，这一差异是由于老年损伤大鼠的CREB1水平显著下降，而老年未受损大鼠的CREB1水平与年轻大鼠相当，幼年大鼠和老年大鼠CREB2蛋白水平无明显变化〔6〕。这些结果表明CREB1蛋白的调控失调可能是导致部分老年人空间记忆障碍的原因之一。另有研究〔7〕丝氨酸(Ser)133上转录因子CREB的磷酸化参与了海马依赖任务的长期记忆的建立，大鼠接受海马内输注单纯疱疹病毒(HSV)-mCREB(一种突变型CREB，其中Ser133已被丙氨酸取代)、HSV-β半糖苷酶结构基因(Lacz)或生理盐水，3 d后接受训练。训练后立即短期试验和11 d长期试验检测大鼠的食物偏好(示范食物与新型食物)。在短期记忆测试中，所有治疗组的大鼠对已证实的食物有明显的偏好。然而，在长期记忆测试中，经mCREB处理过的大鼠所吃食物的百分比明显低于经Lacz或盐水处理的大鼠。定量Western印迹证实mCREB注入大鼠训练组的海马CREB蛋白含量明显高于对照组〔7〕。接下来的研究中通过病毒介导的基因转录来增加海马背侧的CREB水平，在水迷宫实验中与盐水组和Lacz组相比增加海马背侧CREB表达组长期记忆明显增强，需要记住的时间明显缩短〔8〕。在纹状体中增加突变CREB的表达与盐水组和Lacz组相比并没有同样的反映记忆时间上的节省，说明背侧纹状体在反应记忆的形成中起重要作用〔9〕。BDNF是CREB转录表达后的产物，已被证明是长期记忆产生的一个关键因素。在海马背侧CA1区注射重组BDNF可逆转局部抑制蛋白质合成所造成的记忆持续缺陷。重要的是，BDNF能够通过一种胞外调节蛋白激酶(Erk)依赖机制将一条永久的长期记忆轨迹转化为一种持久的记忆轨迹，从而诱导记忆的持久性。BDNF不仅是必需的，而且足以在海马内诱发一个后期的记忆处理阶段，这对于长期记忆储存的持续存在是必不可少的〔10〕。在AD模型Tg2576基因突变小鼠脑组织免疫组化分析显示海马和皮层CREB水平降低，转基因小鼠脑组织中检测到氧化应激标记物，显示星形胶质细胞丰富的区域CREB染色减少〔11〕。在AD患者病死后海马标本中，十二烷基硫酸钠(SDS)提取的Aβ与CREB蛋白水平也呈负相关〔11〕。CREB调控的BDNF和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)抑制剂BIRC-3的水平降低，Caspase-9的活性裂解形式(凋亡的内在途径)升高。大鼠原代海马神经元暴露于Aβ纤维后，CREB启动子活性降低。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可逆转Aβ导致的神经元CREB mRNA水平下降。腺病毒介导CREB过度表达对Aβ诱导的神经元凋亡有明显的保护作用〔11〕。也就是说长期记忆形成的部位是在Aβ斑块沉积易形成的海马区，而CREB的生成可以被单体Aβ42所激活，Aβ的寡聚体可降低CREB的表达。

3 Pen-2

Pen-2是组成γ分泌酶复合体的一部分，与Ps-1、呆蛋白(Nct)、前咽缺陷蛋白(Aph)-1行成复合体，在Aβ的形成和Notch刻痕信号通路中起作用〔12〕。γ分泌酶起催化作用的主要部分是Ps-1，也是γ分泌酶抑制剂的主要作用部位〔13〕。而Nct除了支持和稳定作用外还能对γ分泌酶切割的底物起识别作用。但是当敲除Nct的情况下γ分泌酶的功能不受影响，也说明了Nct在γ分泌酶中不是必需的〔14〕。值得注意的是，PEN-2的羧基端亲水结构域可以促进Ps-1的内源性水解，但对稳定Ps-1的衍生物至关重要。更重要的是，由甾醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1中的跨膜区(TMD)1取代Pen-2的TMD2的嵌合是完全有功能的，而用SREBP-1中的TMD2替换Pen-2的TMD2的嵌合则不是这样。后一种嵌合体的功能是通过将SREBP-1的TMD2近端2/3替换为PEN-2中真实的TMD1的近端2/3来挽救的。这些结果表明，近端2/3的Pen-2 TMD1在功能上对Ps-1全蛋白的内源性分解和Ps-1片段的产生具有重要的作用〔15〕。在一定的PS1、N端氨基端(NTF)/C端羧基端(CTF)表达水平下，Aβ的产生是可饱和的，而Pen-2的过度表达则进一步增加了Aβ的产生。虽然Pen-2并不能促进PS1-NTF/CTF异二聚体的形成，但PEN-2的表达降低了一种过渡态类似物γ-分泌酶抑制剂的半抑制率(IC50)，表明Pen-2的表达增强了底物与催化位点的亲和力或降低了阈值〔16〕。有研究对人源Pen-2基因的上游区域进行了鉴定，并将位于翻译起始密码子上游353 bp的238 bp片段作为启动子活性的关键区域。进一步分析发现，CREB结合位点位于238 bp区域，该区域对Pen-2启动子的转录活性至关重要。CREB位点突变阻断了Pen-2启动子的转录活性。电泳迁移率测定和染色质免疫共沉淀分析表明，CREB在体外和体内均与Pen-2启动子区结合。用CREB激动剂福斯克林(Forskolin)激活CREB转录因子可显著促进Pen-2 mRNA和蛋白的表达，而对γ-分泌酶复合物的其他组分没有影响〔17〕。当Ps-1基因突变导致Ps-1和Pen-2联系减少但不影响γ分泌酶功能和Ps1内分解时，Aβ42∶Aβ40比例升高且不影响Notch信号通路，即当Pen-2表达量降低时Aβ42∶Aβ40升高〔18〕。而在痴呆小鼠模型中使用γ分泌酶抑制剂时加重了小鼠的记忆障碍，这也从侧面说明了Aβ42可能在记忆形成中具有重要作用〔19〕。在过去的报道中有研究通过构建一个携带人源PEN-2的杂交基因，并将其用于人神经上皮细胞的转染，该细胞还与突变体早老素2(hPS2m)和瑞典突变型Aβ前体蛋白(APPsw)共转染。结果表明：(1)人源PEN-2过表达可引起γ分泌酶活性及其蛋白(包括Ps1-CTF、Aph-1和Nct)的增加，从而产生Aβ42的量增加；(2)与hPS2m和APPsw共转染对γ分泌酶蛋白的诱导和活性的影响并与单独转染hPen2相比作用差异不大；由此可见底物和催化活性对于Aβ42的产生并不是必须的〔20〕。但Aβ42的增加作者并未说明Aβ40的变化，而Aβ42与Aβ40的比例变化对Aβ寡聚体和淀粉样沉积的形成有重要意义。综上所述，突变激活Pen2上游CREB结合位点时可增加Pen2蛋白和mRNA的表达，过表达Pen2可增强γ分泌酶及Aβ42的表达，而PS-1及Pen-2的联系减少时即Pen-2表达降低时Aβ42∶Aβ40增加，可以看出Pen2对Aβ42和Aβ40的产生具有调节的作用，但是当Pen-2增加时对Aβ42∶Aβ40是未知的，此时虽然Aβ42的量增加但不能说明比例是否失衡及有无淀粉样蛋白的产生。

4 总结和展望

综上，当CREB的表达下降，Pen-2的表达量将受到直接的影响随之下降，Aβ42与Aβ40的比例增加。当Aβ40单体的量不足以维持Aβ42单体形式，产生Aβ寡聚物甚至沉积而导致CREB的表达进一步受损，形成一个正反馈的闭环。值得继续研究的是，当Pen-2表达量增加时随之增加的Aβ42是否同时伴随着更多的Aβ40的增加、而Aβ40的增加能否真正有效可观的减少Aβ寡聚体甚至沉淀的形成是未来要研究及努力的方向。