兽用疫苗抗原分离纯化技术

严 石,潘春刚,张 健,许 磊,宋 芳,潘京学,杨小蓉,刘兆环,杨君敬

(1.中牧实业股份有限公司,北京 丰台 100070；2.农业农村部兽用生物制品与化学药品重点实验室,北京 海淀 100095)

近年来,随着生物技术的快速发展,运用一系列的技术手段,已设计、制造出多种生物制品。其研发、生产过程大致包括上、下游两个阶段,上游是运用生物技术手段研制目标产物,下游是指对目标产物的料液进行前处理、浓缩纯化等一系列过程。目前,生物制品上游技术发展较快,而下游分离纯化技术发展相对滞后。许多生物制品在实验室已研制成功,却无法向工业化规模生产的方向迈进。

兽用生物制品是作为生物技术领域的一类重要产品,就全球范围而言,其市场一直保持着平稳较快的增长,销售额每年持续增加,市场需求量巨大。

1 国外兽用疫苗的现状与优势

在国外,生物技术的进步推动着动物保健产业的快速发展,同时应用于兽用制品领域,以此不断推出功能更强、效果更好、副作用更低的生物制品,如：兽用疫苗。国外企业已研制出各类兽用疫苗已相继投入市场,其产品主要在提高有效抗原含量方面研究的越来越深入,即在蛋白分离纯化方面,处于绝对优势。

2 国内兽用疫苗存在的问题

近年来,国外企业的兽用疫苗产品陆续投放到国内市场,销量不断增加,其产品具有性状稳定、均一、安全、高效特点,使得国内企业面临巨大的生存压力。在借鉴国外先进经验、技术的前提下,虽然我国兽用疫苗产业得到了一定程度的发展,仍普遍存在管理模式落后、基础设施薄弱、生产条件不高等一系列问题。另外,各企业产品种类虽有所增加,仍存在产品结构不合理、同质化严重、科技创新程度不高的问题。部分企业由于对新工艺的开发研究和关注较少,导致部分产品的质量不稳定、杂蛋白含量高、抗原含量低、免疫保护率低等问题,基于上述原因,国内企业亟待调整产品的结构和工艺,以下游生产工艺为切入点,重点提高抗原有效含量、降低产品的杂蛋白含量为目标,开展纯化工艺技术的研究。

由于兽用产品近几年才开展分离纯化技术与工艺,本人在借鉴人用产品、并与兽用产品结合,进行了纯化技术工艺的综述,为兽用疫苗抗原分离纯化的研究与应用提供支持。

3 兽用抗原纯化的方法

兽用疫苗抗原作为蛋白质,在组成成分、物理、化学、生物性状等方面都存在着诸多差异,其对应的分离纯化方法各异。首先要了解目标蛋白性状诸如溶解度、分子大小、等电点、稳定性、电荷差异等一系列性状,再制定合理的分离纯化步骤、方法,具体步骤、方法视产品而定。

3.1 兽用抗原的前处理 分离纯化目标蛋白首先要将其从原组织或细胞中释放出来,并保持原有的活性。根据目标料液性质不同,采取前处理的方式不同。例如,机械破碎法、渗透破碎法、反复冻融法、超声波振荡、研磨、高压挤压或酶处理等方法,破碎后,选择适当缓冲系统将目标蛋白提取出来,细胞碎片等大颗粒不溶物通过离心、过滤或者微滤的方法除去。

3.2 兽用抗原的分离纯化

3.2.1 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质作为一类重要的生物大分子,根据不同分子大小,可以利用一些方法使其和其他物质分开,达到分离的目的。主要有透析、超滤、密度梯度离心和凝胶过滤等。

透析过滤是分离常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成透析袋中,再浸入透析液达到分离的目的。

超滤是一种加压膜分离技术,即在一定的压力下,使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜,而使大分子溶质不能透过,留在膜的一边,从而使大分子物质得到了部分的纯化。王继华等[1]在口蹄疫二价灭活疫苗抗原浓缩纯化工艺中使用超滤技术可有效降低免疫副反应。刘国英[2]在伪狂犬病抗原纯化浓缩工艺研究中使用超滤技术浓缩10倍杂蛋白去除率约90%。

密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成-连续或不连续的密度梯度,将蛋白混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯、蔗糖和多聚蔗糖。有报道Barteling等[3]建立的定量口蹄疫病毒146S蔗糖密度梯度离心法。另外高顺平[4]等通过蔗糖密度梯度离心技术纯化山羊痘病毒,病毒得到有效富集,病毒颗粒完整。

凝胶过滤又称分子排阻层析,利用某些凝胶对不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异而进行分离的一门层析技术。原理是把不同目标蛋白流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内结构,被排阻珠外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外,比凝胶珠孔径小的蛋白随着溶剂在珠孔内部的流动后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。凝胶过滤在兽用疫苗产品应用得不多,主要集中在人用领域。

3.2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响目的蛋白溶解度的因素有很多,如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同蛋白抗原结构的不同溶解度各异,根据具体分子结构的特点,适当的改变外部条件,选择性地控制目标蛋白溶解度,达到分离的目的。常用的方法有等电点沉淀、调节pH值、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂沉淀。

等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白抗原都有自己的等电点,在等电点时溶解度最低；另外有些蛋白抗原在一定pH值时很容易溶解,可以通过适时的调节溶液pH值来达到分离纯化效果。

盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白溶解度的现象,其中,增加蛋白溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。盐溶有增加蛋白质溶解度的作用,用适量盐离子的缓冲液能从生物样本中提取更多蛋白质。盐析是根据蛋白质分子表面疏水基团含量不同,溶解度不同,被沉淀下来所需的中性盐浓度不同。利用盐溶和盐析对蛋白进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐。

有机溶剂沉淀指与水互溶的有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮,在高浓度下使蛋白质产生沉淀。在加入大量比水介电常数低的有机溶剂,蛋白质表面水化层被破坏,蛋白质沉淀析出。例如在冰浴中磁力棒搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白[5]。冷乙醇法是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用[6]。值得注意的是,在室温下,有机溶剂引起蛋白的沉淀同时,容易变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,不断搅拌加入,防止其变性。

3.2.3 根据电荷不同进行分离纯化 根据目标蛋白的电荷性质不同,分离方法有电泳和离子交换层析两类。

在外电场的作用下,带电颗粒将向着与其电性相反的电极方向移动,这种现象称为电泳。包括如下几种常用的电泳技术：聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺凝胶为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。等电聚焦电泳是根据蛋白质等电点不同而分离、鉴定蛋白质的一种电泳技术,既可分离蛋白质,也可以用于蛋自质的等电点测定。孙臣忠等[7]研究了聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳在分离纯化蛋白质中应用。双向电泳是一种在二维方向上对同一蛋白样品先后进行不同性质的电泳,目的是分离高分辨率的蛋白质。

离子交换层析是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂；反之为阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于目标蛋白的分离纯化。

3.2.4 根据生物分子的特异亲和力进行分离纯化 亲和层析是利用生物大分子与某些相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的层析方法。只需一步处理即可得到纯度较高的某种蛋白质。它是根据不同蛋白质对特定配体的特异而非共价结合的能力不同进行蛋白质分离的。近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白,特别是在融合蛋白的分离纯化上,因为融合蛋白具有特异性结合能力[8]。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛[9]。范继业等[10]利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶的回收率达到62.5%。

3.2.5 根据蛋白质吸附特性分离蛋白质 疏水层析利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离。该方法基于的是蛋白质的疏水差异,在高盐溶液中,蛋白质与疏水配基相结合,而其他的杂蛋白则没有此种性质,利用此种性质,可以将蛋白质初步的分离,用于盐析之后的蛋白质进一步提纯。

4 结语

在实际工作中,很难用单一的方法来实现目标蛋白的分离纯化,往往要综合几种方法才能分离出一种目标蛋白。理想的分离提纯方法,要求产品纯度和回收率越高越好,但实际上两者难以兼顾,因此,考虑分离提纯的条件和方法时,在两者之间作适当的选择。