将分子细胞遗传学内容纳入高等农林院校“遗传学”本科课程教学的建议——以荧光原位杂交技术为例

(北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083)

“遗传学”课程是高等农林院校生物科学、生物技术、林学、草业科学、园艺以及自然保护区等专业的核心主干课程之一，是一门重要的专业必修课程。随着分子遗传学和生物技术的快速发展与进步，基因工程、基因组学以及基因的表达与调控等内容均已写入高等农林院校本科专业的“遗传学”课程教材中，有实验条件的高校也已将基因工程、DNA聚合酶链式反应(PCR)等内容纳入“遗传学”课程实验教学中，唯独缺少从细胞遗传学过渡到分子遗传学的连接桥梁和纽带的分子细胞遗传学。这种相对有缺陷的课程教学内容体系，不仅影响“遗传学”课程知识体系的构建，也不利于推动分子细胞遗传学研究的进步。其中，以荧光原位杂交(FISH)为代表的分子细胞遗传学实验技术在染色体精准识别、染色体作图、染色体畸变、物种进化以及功能基因定位等方面发挥了重要作用。因此，将分子细胞遗传学内容纳入本科生“遗传学”课程教学中就显得非常必要。

一、分子细胞遗传学内容长期未纳入高等农林院校“遗传学”本科课程教学的原因

细胞遗传学是“遗传学”课程与细胞学有机结合而建立的一门遗传学分支科学，是从细胞学的角度，特别是从染色体的结构和功能、染色体与其他细胞的相互关系来研究生物遗传变异规律的科学。而分子细胞遗传学是分子生物学实验技术与细胞遗传学相结合而建立的另一门遗传学分支科学，其主要在分子层面上进行细胞遗传学研究。与经典细胞遗传学相比，分子细胞遗传学的研究范围更为广泛，涵盖了染色体生物学的各方面内容以及分子细胞遗传学技术在生物学和医学方面的应用。

目前，分子细胞遗传学的研究领域主要包括染色体与细胞核的结构和功能、基因组变异、基因表达和进化、染色体畸变以及医学遗传学和肿瘤遗传学中的基因组变异等。通过分子细胞遗传学研究，可以将看不见摸不着的抽象基因定位在染色体上，从而实现染色体物理图谱的绘制。自20世纪80年代以来，尽管分子细胞遗传学实验技术取得了飞速发展，但有关分子细胞遗传学的内容一直未写入高等农林院校本科生的“遗传学”课程教材中。究其原因，笔者认为主要与当时分子细胞遗传学的相关理论和技术难题未攻克有关。

(一)分子细胞遗传学缺乏相对独立的理论体系

原位杂交是分子细胞遗传学研究的核心技术和手段，其基本原理是利用核酸分子单链之间互补碱基序列，将有放射性或非放射性标记的外源核酸单链(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或核糖核酸(RNA)单链进行互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。从上述定义可以看出，核酸原位杂交最基本的原理是利用核酸链间的碱基互补配对原则，即分子遗传学中的查尔格佛(E.Chargaff)定则。因此，诸多学者对分子细胞遗传学的地位提出了质疑，甚至有的学者认为因其缺乏相对独立的理论体系，分子细胞遗传学不能称为遗传学的一门分支科学，原位杂交亦仅仅是一项技术而已。

(二)原位杂交技术作为分子细胞遗传学研究的核心技术存在局限性

原位杂交技术的起源可追溯到20世纪60年代末期，Gall等[1]以携带放射性标记的非洲爪蟾核糖体基因为探针，与其卵母细胞染色体进行杂交，首次实现了核糖体基因的染色体定位，标志着放射性原位杂交技术的诞生。由于放射性标记存在安全隐患，危险性大，Rayburn等[2]以更为安全的生物素取代放射性同位素进行探针标记，与小麦体细胞染色体进行杂交，获得了小麦特异DNA序列在染色体上的准确位置。生物素荧光标记探针取代放射性同位素标记探针成功应用于原位杂交，促进了荧光原位杂交技术(FISH)的快速发展[3]。

20世纪80年代，荧光原位杂交技术进入快速发展时期。由于研究目的多样化，研究人员对荧光原位杂交技术进行改良，产生了一系列改良型荧光原位杂交技术。Durnam等[4]以核基因组为探针进行原位杂交，辨别体细胞内异源染色体，发展了基因组原位杂交(GISH)技术。Nederlof等[5]利用不同的荧光素标记探针，同时定位了不同探针靶序列在染色体上的分布，建立了多色荧光原位杂交体系(M-FISH)。但由于中期染色体高度凝缩，致使高分辨率染色体物理图谱的构建几无可能。为了克服中期染色体高度凝缩这一缺陷，促使以间期细胞为研究对象的纤维荧光原位杂交技术(Fiber-FISH)的产生，显著提高了染色体图谱的分辨率[6]。21世纪初，随着人工合成染色体技术的兴起，使植物单条染色体作图成为可能。Lysak等[7]以人工合成细菌单条染色体为探针，与拟南芥染色体进行荧光原位杂交，发展了细菌人工染色体荧光原位杂交(BAC-FISH)技术，实现了植物单条染色体作图。

近年来，随着基因组测序技术的快速发展，部分植物种，如拟南芥、水稻、杨树以及葡萄等物种基因组测序工作的完成，科学家可以根据物种的单条染色体序列，将染色体DNA序列设计为覆盖整条染色体的寡核苷酸短链，通过PCR扩增后，制备成寡核苷酸(Oligos)探针，与染色体进行杂交，从而获得高分辨率的染色体图谱。Han等[8]首次利用该技术对黄瓜的3号和7号染色体进行了作图研究。该方法最大的优势就是可以根据研究需要，对任何染色体或片段进行人工设计，缺点是受制于是否有基因组序列。

综上所述，尽管原位杂交技术取得了长足进步，但其不同发展阶段的技术自身存在一定的局限性，故此农林高等院校在确定“遗传学”课程教学内容时只能选择放弃。

二、分子细胞遗传学内容纳入高等农林院校“遗传学”本科课程教学的必要性

目前，随着荧光原位杂交技术的发展，植物细胞遗传学研究取得了突破性进展。但由于染色体形态差异，导致小染色体物种难以开展分子细胞遗传学研究，因此部分植物种的分子细胞遗传学研究不能代表植物细胞遗传学的全部。尽管如此，笔者仍然认为有必要尽快将分子细胞遗传学内容纳入到高等农林院校相关专业的“遗传学”课程教学中。

(一)纳入分子细胞遗传学内容是遗传学构建完整知识体系的客观需要

我国高等农林院校现行《遗传学》教材，大多包括遗传的细胞学基础、遗传物质的分子基础、孟德尔遗传、连锁遗传和性连锁、基因突变、染色体畸变、数量性状的遗传、细菌和病毒的遗传、细胞质遗传、基因工程、基因组学、基因的表达与调控、遗传与发育、群体遗传与进化等内容[9]，唯独缺少分子细胞遗传学的内容。这种不完整的“遗传学”课程教学内容，显然不利于学生系统地学习遗传学知识。因此，以荧光原位杂交技术为核心的分子细胞遗传学内容不应被忽视，而应纳入到高等农林院校本科生的“遗传学”课程教学中，这有助于学生构建完整的遗传学知识体系，促进遗传学的发展。

(二)分子细胞遗传学在遗传学研究中具有举足轻重的地位

染色体是遗传物质的主要载体，携带有控制生物性状发育所需要的全部基因。因此，精确识别每一条染色体，获得精准的核型分析图是开展染色体生物学研究的基础。传统的染色体制片和核型分析技术促进了染色体生物学的快速发展。但这些传统的细胞遗传学技术均存在一定的局限性，导致从形态上难以准确区分每一条染色体，特别是对于染色体小且数目多的物种而言，这种局限性犹为明显。荧光原位杂交技术是在传统染色体技术上发展起来的，是传统细胞遗传学实验技术的拓展与补充，可以弥补传统技术的不足。王坤波[10]以基因组DNA和核糖体DNA(rDNA)为探针，利用荧光原位杂交技术对棉属21个种进行了核型分析，并对4个四倍体棉花种的亲缘关系进行鉴定。佘朝文[11]将显带技术和荧光原位杂交技术结合起来，对花生进行了核型分析，建立了花生的核型公式为：2n=4x=40=38m+2sm(SAT)，核型不对称类型属于2A型。荧光原位杂交技术在植物中的广泛应用，使其在继显带技术后，成为核型分析又一重要工具，促进了植物细胞遗传学的快速发展。

1953年，沃森(J.D.Watson)和克里克(F.Crick)提出了著名的DNA双螺旋结构模型，标志着分子遗传学的诞生。基因的概念也从经典“孟德尔遗传因子”发展至现代遗传学的基因概念，即基因是染色体上可转录一条完整RNA分子，或编码一条多肽链的一段DNA序列。因此，基因既看不见又摸不着，更感觉不到它的存在，显得十分抽象。利用已知序列的荧光标记探针与染色体杂交可确定基因在染色体上的物理位置，从而构建染色体物理图谱。张新新[12]利用荧光原位杂交技术和原位PCR技术，将巴西橡胶树乳胶合成相关的4个基因HMGR1、HbRT1、HbCPT、HCPT-3分别定位在3、6、9、10号染色体上。尽管这种物理图谱的分辨率相对偏低，要求两个分子标记之间至少相距1 000 kb才可以成功定位，但仍然对于植物的分子辅助育种和比较基因组学研究有重要意义。张永泰[13]对芸薹属基本种进行物理图谱绘制，并根据定位信息分析探针序列在植物基因组中的进化趋势，为种属间的基因组进化关系研究提供了重要信息。

基因工程是将外源基因导入生物基因组中，改良生物性状的有效技术和手段。常用的转基因生物鉴定方法包括PCR检测和Southern、Northern以及Western杂交。这些传统的分子生物学检测方法可以从不同水平检测目的基因是否整合至核基因组并是否进行了性状表达，但均不能确定目的基因插入至染色体的具体位置。有关研究表明，转化植株性状遗传定性与转入目的基因表达以及插入位置密切相关。另外，外源基因的插入位置也不是完全随机的，其优先插入到染色体的远端区[14]。因此，精准确定目的基因在染色体上的位置显得尤其重要。由于目的基因序列已知，因此以目的基因为探针，利用荧光原位杂交技术，不仅可以检测外源基因是否导入核基因组，还可以直观地观察到外源基因在染色体上的位置[15]。金危危等[16]利用荧光原位杂交技术成功对水稻转基因植株进行鉴定，发现外源基因成功导入核基因组，并将Barnase-ps1基因定位在8个株系的10条染色体臂上，因此荧光原位杂交技术可作为转基因生物鉴定的一种既准确又高效的检测方法。荧光原位杂交等分子细胞遗传学技术在染色体识别和核型分析、染色体物理图谱绘制、比较基因组学、转基因生物外源基因鉴定等方面具有重要作用，应引起科技工作者的高度重视。

三、将分子细胞遗传学内容纳入“遗传学”本科课程教学的实施建议

基于我国高等农林院校现行“遗传学”课程教材缺少分子细胞遗传学内容的事实，笔者就在农林院校“遗传学”课程教学中增加分子细胞遗传学内容提出如下建议。

首先，将以荧光原位杂交技术为代表的分子细胞遗传学内容纳入“遗传学”课程教学，构建涵盖孟德尔经典遗传学、细胞遗传学、分子遗传学、分子细胞遗传学、数量遗传学以及群体遗传学等学科的完整“遗传学”课程知识体系。

其次，优化整合“遗传学”课程实验教学内容，引入“植物根尖材料的收集、预处理与固定”“植物根尖细胞染色体制片”“切口平移法制备45S rDNA分子探针”“植物荧光原位杂交与信号检测”等实验。

四、将分子细胞遗传学内容纳入“遗传学”本科课程教学的意义

笔者将分子细胞遗传学纳入“遗传学”课程教学内容后，弥补了《遗传学》教材缺少分子细胞遗传学内容的缺憾，丰富了“遗传学”课程教学内容，构建了更为完整的遗传学知识体系，促进了知识的融会贯通，强化了创新意识，提高了创新能力。

开设“植物根尖材料的收集、预处理与固定”“植物根尖细胞染色体制片”“切口平移法制备45S rDNA分子探针”“植物荧光原位杂交与信号检测”等实验，不仅优化了“遗传学”课程实验资源，而且还将相对孤立的实验整合为一个整体，使“遗传学”课程实验既包含了细胞遗传学内容又包含了分子遗传学内容，保证了实验内容的系统性和完整性。

资助项目：北京林业大学2018年教改项目“荧光原位杂交纳入本科遗传学实验教学的探索与实践”，项目编号BJFU2018JY045。