HMGB1对人牙周膜成纤维细胞骨钙蛋白和骨涎蛋白表达的影响

蔡军，栾毅君，瞿海涛，刘慧超，王利艳，徐岩

(1 济南市口腔医院，济南250014；2 山东大学齐鲁医院)

牙周病是一类以牙齿支持组织持续破坏为主要特征的细菌感染性疾病，是导致人类牙齿缺失的重要原因。其中，牙槽骨的破坏与吸收是牙周病的主要病理改变之一[1]。研究表明，菌斑细菌及其代谢产物引发的炎症反应、宿主抵抗外界炎症能力降低以及宿主对牙周致病菌易感性增加等均可导致牙槽骨的破坏与吸收[2]。牙周膜成纤维细胞(PDLCs)作为牙周组织的主要功能细胞，在牙槽骨的损伤和修复中具有重要作用[1]。PDLCs有很强的再生和矿化能力，在一定条件下能够向成骨或成牙骨质方向分化，可参与牙槽骨的修复[3]。骨钙蛋白(OC)是一种非胶原蛋白，可反映骨代谢瞬间变化[4]。特定位点龈沟液OC水平可反映局部牙槽骨破坏情况[5]。骨涎蛋白(BSP)是骨新陈代谢的标志物，能激活成骨细胞、成牙骨质细胞或类成骨细胞，引导骨矿化，促进骨或牙骨质形成[6]。因此，PDLCs中OC、BSP表达变化可能会影响PDLCs成骨方向分化以及牙周组织局部成骨微环境[7]。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是一种重要的晚期炎症因子，在许多感染性或无菌性炎症性疾病的发生、发展中具有重要作用[8～10]。有研究表明，牙周病患者牙龈组织以及龈沟液中HMGB1表达升高[11]。提示HMGB1可能参与牙周病的发生、发展过程。本研究观察了HMGB1对人PDLCs中OC、BSP表达的影响，旨在探讨HMGB1在牙周骨组织破坏中的作用机制。现分析结果并报告如下。

1 材料

收集2016年10月～2017年10月济南市口腔医院行正畸治疗拔除的前磨牙10颗。行正畸治疗者体检健康，无龋病或牙周病等，年龄12～18岁。本研究经济南市口腔医院医学伦理委员会批准。DMEM培养基、胰蛋白酶，美国Gibco公司；抗波形丝蛋白抗体、抗细胞角蛋白抗体，武汉博士德生物工程有限公司；OC(sc-74495)、BSP(sc-73497)、β-actin(sc-81178)一抗，美国Santa Cruz公司；RNeasy Mini Kit试剂盒，德国Qiagen公司；SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase试剂盒，美国Invitrogen公司；TaKaRa Ex Taq试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司；细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒，江苏碧云天生物技术研究所。酶联免疫分析仪，芬兰Thermo Labsystems公司；倒置相差显微镜，德国Leica公司。

2 方法与结果

2.2 人PDLCs培养与鉴定 将正畸治疗拔除的前磨牙用无菌PBS清洗3次，刮除牙根中1/3牙周膜，剪切成1 mm×1 mm×1 mm组织块，平铺于培养瓶底；然后将培养瓶加入含15% FBS和100 U/L青霉素、100 μg/L链霉素的DMEM培养基10 mL，瓶底向上倒置于培养箱中，37 ℃、5% CO2、95%湿度下培养2～3 h；待组织块贴壁牢固，翻转培养瓶继续培养；待细胞铺满瓶底70%～80%，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3传代。取传4～6代PDLCs，用含10% FBS的DMEM培养液重悬，制成密度为1×104个/mL的细胞悬液。取细胞悬液1 mL，接种于预先放置细胞爬片的12孔板中，37 ℃、5% CO2、95%湿度下继续培养；待细胞融合50%时，取出细胞爬片，4%多聚甲醛固定。将固定好的细胞爬片用PBS充分振洗，在爬片表面滴加3%过氧化氢，37 ℃温箱孵育20 min；羊血清37 ℃封闭30 min，分别滴加抗波形丝蛋白和抗细胞角蛋白一抗，37 ℃湿盒孵育2 h；然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育30 min；DAB显色5～6 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，倒置显微镜下观察。结果显示，所培养细胞抗波形丝蛋白阳性、抗细胞角蛋白阴性，证实所培养细胞是来源于中胚层的PDLCs。

2.3 HMGB1在体外对人PDLCs OC和BSP表达的影响

2.3.1 细胞分组处理 选择传4～6代PDLCs，用含10% FBS的DMEM培养液重悬，制成密度为5×104个/mL的细胞悬液。取细胞悬液接种于6孔板，每孔1.5 mL，随机分为对照组和HMGB1组，每组设3个复孔。HMGB1组加入适量HMGB1，使其终浓度为100 ng/mL，对照组不予HMGB1处理。然后将6孔板置于37 ℃、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养。

2.3.2 各组OC、BSP mRNA表达变化 采用RT-PCR法检测OC、BSP mRNA表达。收集各组培养24 h细胞，按RNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取细胞总RNA，经紫外分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，表明提取的总RNA纯度合格。调整总RNA浓度为300 ng/μL，根据SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase试剂盒说明逆转录为cDNA，以cDNA为模板，按照TaKaRa Ex Taq PCR试剂盒说明进行PCR扩增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。引物序列：OC上游引物5′-GAGGGCAGCGAGGTAGTGAAG-3′，下游引物5′-GATGTGGTCAGCCAACTCGTCA-3′；BSP上游引物5′-GCACCTCGAAGACACAACCTC-3′，下游引物5′-TGACCATCATAGCCATCGTAGC-3′；GAPDH上游引物5′-GCTCTCCAGAACATCTACC-3′，下游引物5′-GTGTCGCTGTTGAAGTCAG-3′。PCR反应体系共25 μL：模板DNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq酶0.126 μL，dNTP 2 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，dH2O 15.374 μL；反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s共35个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。各组OC、BSP mRNA相对表达量比较见表1。

表1 各组OC、BSP mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3.3 各组OC、BSP蛋白表达变化 采用Western blotting法检测OC、BSP蛋白表达。收集各组培养48 h细胞，加入适量含PMSF的RIPA裂解液，提取细胞总蛋白，经BCA法蛋白定量合格。取部分总蛋白，按照1∶1体积比加入2×loading buffer，混匀，100 ℃水浴10 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白35 μg行10% SDS-PAGE，先以80 V电压跑胶至Marker胶充分分离，再调整电压至120 V，继续跑胶1 h，至溴酚蓝染料到达凝胶底部时结束电泳。采用湿转法将蛋白电泳产物转印至硝酸纤维膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入OC、BSP一抗(稀释比均为1∶200)及β-actin一抗(稀释比为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。次日TBST冲洗10 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释比为1∶10 000)，室温孵育1 h。TBST冲洗10 min×3次，ECL发光，暗室中显影、定影。采用凝胶成像分析系统扫描各蛋白电泳条带，Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。各组OC、BSP蛋白相对表达量比较见表2。

表2 各组OC、BSP蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

牙周病是一类由菌斑微生物引发的牙周支持组织(包括牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)炎症破坏性疾病，其中牙槽骨吸收是牙周病的特征性表现。但目前对牙槽骨吸收的具体机制尚不十分明确[12]。

在感染和损伤性疾病中，HMGB1是一个募集、激活免疫细胞的重要因子，并且在炎症的迁延、恶化中发挥重要作用[10]。由于牙周病是一种炎症性疾病，故推测HMGB1在牙周病进展过程中可能亦具有重要作用。Ebe等[13]研究发现，HMGB1分布于牙周袋上皮细胞胞质中，而牙周袋中致病菌的代谢产物可诱发牙周膜细胞坏死，继而释放HMGB1。HMGB1亦可高表达于牙周病患者牙龈上皮细胞中，且其龈沟液HMGB1水平明显升高[14]。本课题组前期研究发现，一定浓度的HMGB1可使PDLCs中RANKL/OPG升高，并能诱导炎症因子IL-6 mRNA表达上调[15]。这些研究结果提示，HMGB1可能参与牙槽骨的破坏和吸收。

OC是一种激素样蛋白，可激活前破骨细胞，加速诱导破骨细胞分化，促进骨吸收[4]。孙靖临等[5]研究发现，牙周炎患者龈沟液OC水平明显高于健康者，提示牙周病变处局部牙槽骨有破坏，故其水平明显升高。宗敏等[16]研究发现，侵袭性牙周炎患者龈沟液OC水平明显高于健康者，经治疗，龈沟液OC水平明显降低。表明特定位点龈沟液OC水平可反映局部牙槽骨变化。BSP是一种分泌蛋白，对钙和羟基磷灰石有高亲和力。BSP亦是一种骨代谢标志物，能够诱导激活成骨细胞、成牙骨质细胞或类成骨细胞，引导骨矿化，促进骨和牙骨质形成[6，17]。在牙周组织中，BSP可促进成牙骨质细胞的附着和分化，继而促进牙周纤维生长。在非细胞牙骨质的形成过程中，BSP有助于保持牙根面牙骨质的完整性以及牙周组织功能的发挥[18]。

本研究结果发现，HMGB1组OC mRNA和蛋白表达均明显高于对照组，与以往文献[5，16]报道基本一致。表明牙周炎患者龈沟液中增多的OC亦可能来源于牙周袋内感染的PDLCs分泌，而HMGB1能通过增加OC表达，促进牙周骨组织中破骨细胞分化，加重骨吸收，进而使牙周炎症迁延。本研究结果还发现，HMGB1组BSP mRNA和蛋白表达明显低于对照组，表明HMGB1可抑制牙周骨组织的修复和再矿化，加重牙周骨组织破坏，导致炎症过程持续。但HMGB1对OC、BSP具体调控机制以及在牙周其他组织中的作用尚不完全清楚，仍需进一步研究。

综上所述，HMGB1可能通过影响人PDLCs中OC、BSP表达，从而参与牙周病中牙槽骨的破坏，继而促进牙周病发展。