类风湿关节炎患者PBMC中凋亡相关蛋白Bcl-2与c-FLIP的表达及其意义

林美娜,章 涛,许瑞元,梅序桥,郭月丽

(1漳州卫生职业学院医学技术系临检教研室,漳州 363000;2福建医科大学基础医学免疫系;3福建医科大学附属漳州市医院检验科;*通讯作者,E-mail:zjdrzht@mail.fjmu.edu.cn)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以持续性滑膜炎症、系统性炎症和关节不可逆损伤为特征的自身免疫性疾病。当前,RA的病因及发病机制尚不明确[1]。曹永贺等[2]通过RA外周血CD4+T细胞凋亡相关蛋白的研究,认为CD4+T细胞凋亡不足,机体免疫状态紊乱,分泌的大量的炎性细胞因子作用于关节滑膜组织,形成血管翳,侵蚀或破坏骨和软骨,造成关节损害,引起RA的发生或加重。由于RA是一种系统性炎症性疾病,其免疫病理事件涉及循环中大部分的淋巴细胞、单核细胞等,且关节内的活化炎症细胞均可由外周激活的细胞池中募集而来。因此,对PBMC的研究可能更能反映患者的整体病理状况[3]。本研究采用real-time qPCR方法检测RA患者PBMC中bcl-2、c-FLIP、caspase-8凋亡相关蛋白的mRNA表达水平,采用蛋白免疫印迹法检测c-FLIP、caspase-8蛋白表达水平,分析它们与疾病不同活动期的相关性及其在RA中的意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2014-01～2015-06入住漳州市医院血液风湿内科的患者60例,其中女40例,男20例,平均年龄(46.75±13.52)岁(32-78岁),类风湿关节炎的诊断标准为2010年美国风湿病学会与欧洲风湿病学会联合提出的类风湿关节炎诊断标准[4]。按RA疾病活动指数(DAS28)将60例标本分为低度活动期组(DAS28<3.2)22例、中度活动期组(DAS28 3.2-5.1)20例、高度活动期组(DAS28>5.1)18例。25例门诊健康体检者设为对照组,其中女18例,男7例,平均年龄(45.35±14.02)岁(31-80岁)。RA组和对照组均排除其他自身免疫性疾病及肿瘤的可能,采血前2周无任何感染性疾病史。

1.2 主要试剂与仪器

引物序列由上海生工有限公司设计合成;Anti-CFLAR TRUEMAB Antibody Clone OTI2D3购于美国ORIGENE公司;Caspase-8 Antibody、Beclin 1 Antibody购于无锡药明康德新药开发股份有限公司;RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、HRP标记的抗兔二抗购于北京全式金生物技术有限公司。721分光光度仪购于上海精科实业有限公司;JY-SCZ4+型垂直板电泳转移装置购于生工生物工程(上海)股份有限公司;GIS300凝胶成像分析系统购于南京驰顺科技发展有限公司;real-time qPCR仪器购于美国ABI公司。

1.3 临床资料收集

收集整理60例类风湿关节炎患者的相关临床资料,如:患者的性别、年龄、病程以及用药等一般情况;血沉(ESR)、C反应蛋白、类风湿因子RF、抗CCP等辅助检查结果信息;晨僵持续时间、疼痛程度、疼痛持续时间、疼痛28关节计数、疼痛总数、(DAS28)活动度等患者病例情况。

1.4 PBMC的提取和处理

分别采集健康体检者和RA患者静脉血2 ml,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法[5]分离PBMC,一部分-20 ℃过夜保存,另一部分-80 ℃保存用于后续试验。

1.5 荧光定量PCR检测Bcl-2、c-FLIP、caspase-8 mRNA的表达

总RNA的提取:参照北京全式金生物技术有限公司(TransGen)RNA提取试剂盒TransZol Up Plus RNA Kit(Cat.No.:ER501-01)说明书。PBMC经PBS洗涤后加入1 ml Trizol充分裂解;加入氯仿200 μl混匀、室温静置5 min;4 ℃ 12 000 r/min离心5 min,取上清约400 μl转移到新的EP管中;加500 μl预冷异丙醇,静置10 min,4 ℃ 12 000 r/min离心10 min;加入1 ml无水乙醇洗涤沉淀物,4 ℃ 8 000 r/min离心5 min;加入50 μl DEPC水,56 ℃助溶总RNA经紫外分光光度计定量,-80 ℃保存备用。

RNA逆转录：RNA逆转录参照RNA逆转录试剂盒Trans Script Reverse Transcriptase[M-MLV,RNaseH](Cat.No.:AT101-02)说明书进行。提取总RNA分光光度计定量RNA,模板RNA加water共10.5 μl，加入primer Random或Oligo(dt)1 μl，85 ℃ 5 s后置冰上。反应条件：Step 1，42 ℃ 15 min；Step 2，85 ℃ 5 s。得到的cDNA放置-20 ℃冰箱中备用，或者立即用于real-time qPCR反应。

real-time qPCR:反应体系及反应条件采用北京全式金生物技术有限公司(TransGen)荧光定量PCR试剂盒进行优化,确定最佳的模板浓度、退火温度,确保PCR引物的特异性及PCR扩增效率(引物见表1)。在冰上进行配制real-time qPCR扩增反应体系:2×TransStarTMTop Green qPCR SuperMix 10.0 μl;Forward Primer(10 μmol/L)0.4 μl;Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μl;cDNA template 2.0 μl;ddH2O Up to 20 μl。每个反应重复3次,配制反应体系时先配制总的反应液,再各个分装。选择Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行定时定量PCR反应。反应结束后,以GAPDH为内参基因,2-ΔΔCt法分析基因表达水平,比较各基因分别在不同组织样本中的表达差异,得到表达差异分析结果。

表1 实时定量RT-PCR引物系列Table 1 Primer sequences for real-time RT-PCR

1.6 Western blot检测c-FLIP、caspase-8表达水平

PBMC细胞,用1×PBS洗2次,加入含蛋白酶抑制剂cooktail的RIPA强裂解液400 μl,冰上充分裂解15 min;将裂解液移入1.5 ml离心管,在冰上用超声细胞裂解器裂解;将液体移入1.5 ml离心管,4 ℃,12 000 r/min离心15 min;取上清移入另外一新离心管;BCA法进行蛋白定量;蛋白样品加入1/4体积上样缓冲液沸水煮5 min,使蛋白质充分变性。经SDS-PAGE,湿式转膜法将胶上的蛋白条带电转移至NC膜上,恒压100 V,冰浴中转120 min;NC膜用5%脱脂牛奶室温封闭1 h,TBST洗膜5 min;将膜封入含1 ∶1 000稀释一抗的塑料袋中,置于4 ℃摇床孵育冰箱过夜,TBST洗膜5 min,3次;将膜封入含1 ∶5 000稀释二抗的塑料袋中,室温摇床孵育1 h,TBST洗膜5 min,3次;扫描胶片,用南京驰顺科技发展有限公司的GIS300凝胶成像分析系统分析目标带的分子量和光密度相对比值。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 RA患者PBMC中Bcl-2、c-FLIP、caspase-8 mRNA表达情况

经组间两两比较,各组RA患者PBMC中Bcl-2 mRNA仅低活动组水平升高(P=0.009),中、高活动组明显降低。c-FLIP mRNA低、中、高活动组均明显高于健康对照组(均P<0.05),且呈递进性升高。caspase-8的低、中、高活动组mRNA也均高于对照组(均P<0.05),以中活动组为最高(见表2)。

表2 各组Bcl-2、c-FLIP、caspase-8 mRNA表达情况Table 2 Comparison of Bcl-2, c-FLIP and caspase-8 mRNA expression among four groups

2.2 RA患者PBMC c-FLIP、caspase-8蛋白表达变化

中活动组RA患者PBMC c-FLIP蛋白表达显著高于健康对照组(P<0.05),低、高活动组与健康对照比较,无统计学差异;中、高活动组RA患者PBMC caspase-8蛋白表达明显高于对照组(P<0.05);低活动组与对照组比较,无统计学差异(见表3,图1)。

表3 各组c-FLIP、caspase-8蛋白表达结果Table 3 Western blot results of c-FLIP and caspase-8 protein expression

图1 c-FLIP、caspase-8蛋白表达Western bolt结果Figure 1 Protein expression of c-FLIP and caspase-8 by Western blot

3 讨论

类风湿性关节炎是一种常见的系统性自身免疫性疾病,主要特性是滑膜组织炎症,引起关节损伤,导致功能障碍[6]。关节病变与成纤维细胞样滑膜细胞肿瘤样增生和细胞凋亡之间失去平衡有关[7]。

细胞凋亡是一种生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下,其死亡途径被激活,在相关基因参与的调控下发生的程序性死亡的过程。目前主要包括两条经典途径:内源性途径和外源性途径。外源性途径也称作死亡受体途径,由于各种细胞凋亡信号的刺激,fas类死亡受体与相应配体相结合,信号传递到细胞内部,吸引了胞质中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD的结合,形成死亡诱导信号复合物DISC,募集并激活caspase-8,从而引起下游caspase-3等的级联反应,导致细胞凋亡。内源性凋亡途径又叫线粒体途径,在内源凋亡信号刺激下,线粒体外膜的完整性丧失,凋亡性膜间蛋白(如细胞色素C)释放,细胞色素c与Apaf-1在ATP/dATP存在下发生构象变化,形成凋亡体,同时凋亡体吸引caspase-9前体加入该复合体,引起凋亡起始分子caspase-9凝集和激活。caspase-9激活效应分子caspase-3引发凋亡的降解过程[8]。

Bcl-2是目前研究比较广泛的凋亡抑制蛋白。Bcl-2由B淋巴细胞瘤-2基因编码的产物,是细胞存活促进因子,属膜整合蛋白,分子量为26 kDa,定位于线粒体、内质网和连续的核周膜[9]。Bcl-2的生物学作用是调控细胞的存活期,而不影响细胞增殖[10]。Bcl-2可以通过参与信号传递而抑制细胞凋亡[11]。在发生凋亡过程中,Bcl-2家族的促凋亡蛋白(如Bax)在移位到线粒体膜上后,很快形成同源二聚体,破坏线粒体完整性,释放线粒体内的促凋亡因子,经过细胞信号转导途径逐步放大,最终导致凋亡发生,而Bcl-2可以与Bax形成二聚体,从而导致在Bax诱发凋亡过程中对其功能进行限制[12]。

有关Bcl-2在RA的细胞凋亡作用有一定的研究,然而研究报道不一,NaKajima等[13]首先报道了RA滑膜细胞表达fas抗原,且fas抗体可诱导滑膜细胞凋亡。CD4+T细胞凋亡减少与促凋亡基因Fas表达减少,凋亡相关蛋白caspase-8表达降低及抑制凋亡基因Bcl-2表达增高有关[14]。而Isomaki等[15]在对RA患者细胞凋亡的相关研究中,未观察到PBMC和滑膜组织中Bcl-2表达的增加,推测Bcl-2可能没有发挥重要作用。本研究外周血单个核细胞Bcl-2 mRNA中只有低活动组高于健康对照组,中、高活动组反而降低,差异有统计学意义,caspase-8的mRNA低、中、高活动组均高于健康对照组,caspase-8蛋白表达低活动组与健康对照组比较无显著差异,中、高活动组显著增高,Bcl-2的凋亡抑制作用体现不明显。

c-FLIP是20世纪末发现的一种凋亡抑制蛋白,它在多种肿瘤和炎症反应中,可以阻断肿瘤坏死因子α(TNFα)、Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)等诱导的凋亡。Fas介导形成的DISC活化caspase-8的能力主要受到c-FLIP的调控,c-FLIP存在几种结构上类似于caspase-8但缺乏酶活性的异构体,c-FLIP的两个DED在体外能与FADD和Caspase-8结合,抑制Caspase-8结合到DISC上,使DISC丧失介导处理和释放有活性的caspase-8的能力,从而阻断了Fas介导的凋亡信号转导[16]。

目前,c-FLIP在类风湿性关节炎中有了一定的研究。国外有研究发现,RA的滑膜细胞及淋巴细胞对Fas介导的凋亡敏感性降低与DISC形成障碍,特别是与Caspase-8激活受到抑制有关,而FLIP的表达增加则可能参与了抑制DISC的形成并抑制Caspase-8的激活[17]。吴凤霞等[18]研究结果认为RA滑膜组织中抗凋亡分子FLIP表达增高,而且与RA滑膜炎症程度积分相关。本研究PBMC中c-FLIP mRNA水平低、中、高活动组分别随着RA疾病的进程逐渐增加,Caspase-8总体趋势增加,这可能是c-FLIP的DED区与Caspase-8结合,竞争性抑制Caspase-8结合到DISC上,阻碍Caspase-8的活化,从而抑制细胞凋亡。c-FLIP蛋白水平只有M组明显增高,可能与c-FLIP的转录调节有关。

综上所述,本研究PBMC中c-FLIP mRNA表达水平随着RA疾病的进程增高,而Bcl-2只有低活动组有明显增高。相比Bcl-2,可能c-FLIP在RA的凋亡抑制作用更大。由于细胞凋亡参与的途径多样、涉及的因子复杂,有关RA凋亡机制在PBMC中的研究还有待进一步的深入,本研究初步探讨了Bcl-2、c-FLIP等凋亡相关蛋白的表达水平及其作用机制,可为后续研究提供一定的参考。