我国猪德尔塔冠状病毒病的流行情况及分子生物学检测方法研究进展

于新友，李天芝

(山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600)

猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus， PDCoV) 又称为猪δ 冠状病毒或丁型冠状病毒，它是近几年新发现的一种病毒[1]，可引起猪的腹泻。PDCoV 为冠状病毒科、δ 冠状病毒属[2]，病毒粒子呈球形，直径大小约120 ～180 nm，具有囊膜和纤突。2009 年中国香港科研工作者首次报道了PDCoV 的存在，但并没有涉及其致病性。直到2014年美国一猪场发生了由该病毒引起的仔猪腹泻，才证实了该病毒的致病性，病毒分离后的仔猪攻毒试验，又进一步进行了验证，随后，加拿大、中国、韩国、越南、老挝等国均有相关报道。近年来，该病发病率有上升的趋势。

PDCoV 病主要通过消化道传播，发病急，传播迅速。各品种和日龄的猪均可感染，主要临床表现为水样腹泻、呕吐、和脱水等；病变主要在小肠，尤其是空肠和回肠，表现为肠壁变薄，肠内充满气体和黄色液体，肠黏膜脱落，临床上很难与PEDV 等其他病毒性疾病鉴别。哺乳仔猪感染后受到的危害严重，死亡率高，生长猪和成年猪感染后死亡率低[3]。易与PEDV、TGEV、RV 等混感，致猪死亡率增加，给养猪业造成了严重的经济损失。

PDCoV 为不分节段的单股正链RNA 病毒，基因组全长约 25.4 kb[4]，括5′端非编码区，3′端非编码区，编码 4 个主要结构蛋白，分别为表面纤突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳(N)蛋白。其中 N 蛋白含量高，免疫原性强，保守性好，在病毒感染猪后针对该蛋白的抗体最早产生、且持续时间最长，是适合血清学诊断方法的首选靶蛋白。M 基因高度保守，是分子检测的首选靶基因，S 基因则是病毒做变异分析的首选靶基因。PDCoV 可用猪睾丸细胞和猪肾上皮细胞进行该病毒的分离培养，细胞病变表现为变圆、聚集，最后脱落，但通常病毒分离培养较困难，需添加胰酶、胰腺酶等，否则即使能分离病毒滴度也比较低。文章就近年来PDCoV 在我国的流行情况及分子生物学检测方法研究进展进行综述，以期为PDCoV 病的快速诊断和防控提供参考。

1 我国猪德尔塔冠状病毒病的流行情况

病猪和带毒猪是主要传染源。病毒通过粪便、乳汁、唾液等分泌物排出体外，污染饲料、饮水及周围环境，通过消化道传染其他健康猪只。PDCoV 可感染亚洲豹猫和中国白鼬獾群等，但猪是目前感染后唯一有发病报道的动物。成年猪常呈一过性腹泻，哺乳仔猪死亡率高。PDCoV 一年四季均可发生，冬春季节多发。PDCoV 在我国各地猪场广泛存在，不同省份和地区均有相关报道，2012—2015 年采集自江西省各地区的249 份腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本进行病原检测，结果显示，腹泻样本中PDCoV 的检出率为31.33%(78/249)，其中母猪粪便中PDCoV 的检出率(27.78%)，仔猪粪便及肠道样品PDCoV 的检出率(31.92%)。2014—2015 年河南、湖南、浙江、江西、安徽、河北、黑龙江、江苏、山东和上海等10 个省市共254 份腹泻仔猪小肠匀浆或粪便样本，共检出11 份PDCoV 阳性样本，阳性率为4.33%。2014—2015 年我国华东地区猪场送检的526 份临床样品检测结果显示，PDCoV 总阳性率为4.75%（25/526），腹泻样品阳性率为25.76%(17/66)。2016—2017 年 对 河北省130 份仔猪腹泻样本检测，结果显示，PDCoV 的检出率为16.9%，PEDV 的检出率为66.2%，二者同时感染的检出率为2.3%。2012—2016年广东省420 份猪腹泻病料样品检测结果显示，PDCoV 的阳性率为13.33%，PDCoV 与猪流行性腹泻病毒混合感染率为5.95%[5]。2015—2017 年四川省各地区226 份猪腹泻样品检测结果显示，PDCoV 阳性样品16 份，阳性率为7.1%。

2 分子生物学检测方法研究进展

2.1 常规RT-PCR 法

RT-PCR 是以病毒的RNA 为模板进行反转录，再以PCR 进行核酸扩增来检测病毒的方法，较病毒分离鉴定等传统的方法，检测速度快，灵敏度高，在动物疾病诊断上得到了广泛的应用。张帆帆等[6]根据PDCoV N 基因设计引物，建立了PDCoV RT-PCR 检测方法，该法特异性好，对PDCoV 仅扩增出了329 bp 的单一条带，而对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪库布病毒（PKoV）、猪星状病毒（PAstV），猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）及猪瘟病毒（CSFV）的核酸无交叉扩增现象，检测灵敏度，最低检测限为1.0×103拷贝/μL。逄凤娇等[7]根据Gen Bank 中登陆的PDCoV M 基因核苷酸序列，设计合成1 对特异性引物，建立了一种基于M 基因的PDCoV RT-PCR 检测方法。该方法特异性较好，仅对PDCo V 有特异性的扩增，对其他主要猪病病毒核酸扩增均呈阴性，敏感性较高，最低检测限可达6.33×104拷贝/μL。郑丽等[8]建立了检测PDCoV 的RT-PCR 方法，并对其敏感性、特异性和重复性进行了检测。结果显示，仅PDCoV 阳性模板可扩增得到359 bp 的目的条带，而PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV、轮状病毒（RV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型（PCV2）、伪狂犬病毒（PRV）、猪链球菌2 型、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示，该方法能检测到的最低核酸质量浓度为1 ng/L。刘浩宇等[9]建立的RT-PCR 检测PDCoV 的方法能够扩增出654 bp 的目的基因片段，其最佳退火温度为60 ℃，上下游引物量为1.75 μL，且与PEDV、TGEV、日本乙型脑炎病毒(JEV)、RV、PRRSV、CSFV 等无交叉反应，该方法最低可检出8.82×109IU/mL 的PDCo V 核酸。

2.2 多重RT-PCR 法

多重PCR 是一种特殊的PCR技术，它在同一PCR 体系中，加入多对引物，同时检测2 种或2 种以上的病毒DNA，它具有快速、灵敏度高、高效、特异性强等优点而广泛用于临床的快速诊断。任玉鹏等[10]根据GenBank 中PEDV 和TGEV 基因序列保守区设计2 对引物，参照文献合成1 对PDCoV 引物，优化3 对引物在同一RT-PCR扩增体系下的浓度、退火温度等反应条件，同时优化方法的灵敏度、特异性。结果表明，本试验建立的多重RT-PCR 在引物量分别为PEDV 0.2 μL，PDCoV 0.2 μL 和TGEV 0.4 μL，退火温度为53℃时的扩增效果最佳，最低检测量分别 为PEDV：60.96 pg、PDCoV：58.85 pg、TGEV：102.69 pg。用该法对多种猪传染病病原DNA或cDNA 进行扩增时均无非特异性扩增条带出现。刘玲玲等[11]根据Gen Bank 中收录的PDCoV N 基因和TGEV N 基因序列设计了2 对引物，通过对RT-PCR 反应条件的优化，建立了同时检测PDCoV 和TGEV 的双重RT-PCR 方法，结果显 示，该 法 对PDCoV 和TGEV 的最低检测量分别是3.14×102copies/μL 和3.68×103copies/μL，该法特异性好，对PEDV、PBoV、PRRSV、PRV 检测的检测结果均为阴性。韩丽等[12]根据GenBank 中登录的PDCoV N 基 因 和PEDV M 基 因 序列，设计了2 对引物，通过对反应条件进行优化，建立了同时检测PDCoV 和PEDV 的 双 重RT-PCR检测方法。结果显示，该双重RTPCR 对PD-CoV 和PEDV 的 最 低检测量分别是3.14×103copies/μL和3.88×104copies/μL。该 方 法 仅对PDCoV 和PEDV 检 测 为 阳 性，对TGEV、猪博卡病毒(PBoV)、PRRSV 和PRV 等猪常见的感染病毒的扩增均为阴性，说明该方法具有较好的特异性。韦学雷等[13]建立 了PDCoV、PEDV 和TGEV 三重RT-PCR 检测方法，该法对三种病毒检测的敏感性分别为3.14×103拷 贝/μL、3.88×104拷 贝/μL 和3.68×104拷 贝/μL。所 建 立 的 方法具有较好的特异性，对PBoV、PRV、PRRSV、CSFV 和PCV2 等猪常见病毒的扩增结果均为阴性。

2.3 荧光RT-PCR 方法

荧光RT-PCR是在常规RT-PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，它融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，检测速度快、敏感高，可直接观察扩增结果，不需要后续电泳检测扩增产物，较少了对环境气溶胶污染的可能，避免了假阳性结果。据信号基团的不同，实时荧光定量PCR可以分为染料法和探针法2种。秦毅斌等[14]根据PDCoV N基因序列在保守区设计合成特异性引物和TaqMan探针，建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示，该方法仅对PDCoV出现特异性扩增反应，与PEDV、TGEV、RV、PKoV、PRRSV、PRV、CSFV及PPV均无交叉反应。该方法的标准曲线Ct值与2.2×109～ 2.2×101copies/μL之间的质粒浓度具有良好的线性关系，标准曲线方程为Ct=-3.539×lgX+38.95，线性相关系数(R2)为1.0，检测下限为2.2 copies/μL。陈小金等[15]根据Gen Bank登录的PDCoV毒株序列设计特异性引物，建立了检测PDCoV的实时荧光PCR方法。该方法在标准品浓度2.49×108～2.49×102copies/μL范围内线性关系良好，特异性试验显示，其他几种常见猪病病毒未见典型扩增曲线，敏感性试验显示，最低检测下限为24.9 copies/μL，重复性试验显示，批内和批间变异系数小于3%。罗尚星等[16]根据PDCoV N基因和PEDV M基因的保守序列，设计了两对特异性引物，建立了一种检测PDCoV和PEDV的双重的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法。结果表明，试验所建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法对PDCoV和PEDV的最低检测量分别为51/μL和32拷贝/μL，且与PBoV、TGEV、PRV、PCV2无交叉反应，特异性较好。张利卫等[17]建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR Green Ⅰ双重荧光RTPCR方法，结果显示，该法最低能检测到PDCoV和PEDV分别是28.6拷贝/μL和99.6拷贝/μL的质粒浓度，显示出较好的敏感性，在同样扩增条件下该方法具有较好的重复性，特异性试验表明，该方法仅能检测出PEDV和PDCoV，而对TGEV、PRRSV、PCV2和PRV等均不产生特异性扩增曲线。单颖等[18]建立了PDCoV一步法TaqMan探针荧光定量检测方法，该法特异性好，对其他病原检测结果均为阴性，检测灵敏度可达3.94×102拷贝/μL，扩增效率为108%，R2值为0.997，标准曲线方程为Y=-3.156X+1.826。肖帅等[19]根据Gen Bank中已公布的PDCoV N基因序列设计并合成特异的引物和TaqMan探针，构建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果显示，以PEDV、TGEV、PKoV、PRRSV、和口蹄疫病毒（FMDV）为模板时均未检测到荧光信号，表明该方法具有良好的特异性，用2.66×106、2.66×105和2.66×104copies/L这3个不同浓度的质粒标准品进重复试验，循环阈值Ct的变异系数均低于2%，表明该方法具有良好的特异性，标准曲线斜率为-3.461，相关系数为R2=0.998，表明阈值和模板浓度之间具有良好的线性关系。10倍梯度稀释质粒标准品，检测的最低限度为2.66×101copies/L的质粒DNA，表明此方法具有良好的敏感性。张利卫等[20]根据Gen Bank中公布的PDCoV M基因序列设计一对特异性引物，以SYBR Premix ExTaq为荧光染料，通过对扩增条件的优化，建立了针对PDCoV的荧光定量RT-PCR检测方法，结果显示，所建立的方法具有高度敏感性，最低检测限为54拷贝/μL，应用该方法对TGEV、PEDV和PRRSV等其他常见猪病毒性病原检测均为阴性，表明所建立的方法具有较好的特异性，且具有较好的重复性，组内和组间变异系数均小于1%。

2.4 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增(LAMP)方法是日本学者Notomi 等发明的一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，不需要复杂的仪器设备，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果可通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，具有灵敏度高、操作简单、反应时间短、临床使用不需要特殊的仪器等优点，特别适合在现场和基层部门应用。王乃福等[21]针对PDCoV N 基因设计特异性引物，并从反应时间、温度、各组分浓度等方面优化了反应体系和反应条件，建立了PDCoV 逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法。该方法能够在65 ℃条件下1.5 h内实现PDCoV N 基因片段的特异性扩增，与其他病毒，如TGEV、PEDV、RV、FMDV、水泡性口炎病毒（VSV）等的核酸无交叉反应。反应结束后，可在扩增产物中加入2μL50 倍 稀 释 的SYBR Green I 染料，在紫外灯和日光下观察反应管颜色变化，将扩增管在可见光下观察如呈黄绿色，则判为阳性，如为橘红色，则判为阴性。对质粒DNA的最小检测量为10 拷贝/μL。何颖等[22]建立了PDCoV RT-LAMP 检测方法，该方法能够在63 ℃条件下1 h 内检测反应，与其他病毒，如PEDV、TGEV、PKoV、PBoV、PPV、PCV2 和PRV 等的核酸无交叉反应。反应结束后，在可见光下，通过肉眼直接观察反应结果，如果反应管呈明显浑浊，短暂离心后，管底部有白色沉淀物，则为检测阳性，如果反应管透明，则判为阴性。该方法对病毒RNA 检测的敏感度为2.47×10-10ng/μL。

3 小结

疾病的正确诊断是进行有效防控的前提和基础，随着规模化养殖的发展，临床上的猪病变得越来越复杂，老病新发和疾病混感现象增加，很难通过临床表现和眼观病变诊断疾病，需要通过实验室进行精准诊断，从而及时采取有效的措施，降低损失。PDCoV 病是猪的一种新发的一种病毒性腹泻传染病，在临床表现上与PED、TGE 和猪轮状病毒病等类似，很难鉴别诊断，只有通过实验室方法鉴别。血清学检测检测方法不能判定是否现症感染，且PDCoV抗体检测法尚未得到很好的验证，所以最好进行病原检测。虽然病原学检测很多，但其他方法都有一定的缺陷，如病原分离鉴定要求高，耗时长，对临床疾病的诊断不实用，胶体金检测方法虽然检测快速，但检测敏感性低，且当前市场上还未见PDCoV 检测产品，产品的研制开发需要一定的时间。相对而言，分子生物学检测方法是最适合PDCoV 临床疑似病例检测的方法。虽然PDCoV 分子生物学检测方法多样，但各有利弊，常规RT-PCR 方法虽然检测速度快、特异性强，但不能定量，且检测敏感性不高。荧光RT-PCR方法虽然克服了常规RT-PCR 的缺陷，但仪器和探针的合成价格昂贵，检测成本比较高，不适合基层应用。LAMP 方法虽然简单、方便，适合基层进行推广应用，但灵敏度太高，易出现假阳性结果。

随着检测技术的不断发展，已经出现了免核酸提取荧光PCR扩增技术、便携式荧光PCR 仪器及除模板外PCR 组份冻干保存技术，如能应用于PDCoV 分子检测，必将开发出更方便、快捷、成本更低的病毒分子检测技术，方便疾病快速确诊，从而更好做好PDCoV病的防控工作。进行病料检测时一定要选择合适的病料样品，对急性发病期的猪可选择新鲜的粪便或唾液样品检测，从死亡猪只采集的空肠或回肠内容物尽早送实验室检测，不要采血清或全血样本，要保证病料样品的新鲜程度，采样要具有代表性，多选几份样品，要把握采样的时间，发病后期所采集的样品可能检测不到病毒。针对该病尚无有效的治疗方法，国内也无疫苗预防，确诊后只能对症治疗，从生物安全方面进行控制，加强饲养管理，提高猪只机体抗病力。猪舍加强保温，保持猪舍清洁卫生，做好消毒工作，定期通风、降低氨气浓度、减少饲养密度、减少应激以降低PDCoV 病发病率和病情的严重程度。