PCR技术在中药检验中的应用

崔璐 郑振秋

（临沂市检验检测中心 山东临沂 276000）

1 前言

历过多年发展， 我国中药学已经取得了较大成就。但在中药市场仍存在混伪品的情况，人们应通过先进的PCR技术（聚合酶链式反应）对其进行检验，促进我国中药学的健康发展。

2 PCR技术的概念

PCR技术是指基于聚合酶链式反应的一项可扩充特定DNA（脱氧核糖核酸）片段的技术，隶属于分子生物学。这项技术的最大特点是可以有效扩充微量DNA。在现实生活中，这项技术发挥着十分重要的作用。从生物化石或人体遗骸甚至是中药中，都仅需提取少量的DNA，然后借用此技术对其进行扩充，就可以得到用于后期比对的样本。

3 中药检验的意义

在医学方面，品质优良的药材可以促进病人早日恢复身体健康，而混伪药材的药效较差，会对病人的身体造成负面影响。除此以外，这些混伪药材还会影响药品研发、医疗科研等方面，长此以往，不仅会造成经济损失，还有可能延误病人的病情发展。当前造成中药质量参差不齐、 易出现混伪品的主要原因有：（1）人为因素，出现误买、误用等行为；（2）外观、名称相近的药影响使用者的判断；（3）受到经济利益的驱使，不法分子故意售假。

中药的质量会直接对药量的使用及药效产生影响。 所以，在明确所需的中药品种后，应对其进行仔细检测，避免使用混伪品。

4 以PCR技术为基础的分子生物检验技术

4.1 PCR-RFLP 技术（限制性片段长度多态性聚合酶链反应）

这项技术不仅可以检验出不同的中药种属，还可以依据现今的市场行情，对药材的掺伪程度进行半定量检验。 张文娟等[1]就借助该技术研发出了可以检测川贝母中的添加伪品的半定量方法。具体操作方法是：首先，提取川贝母粉中的DNA；然后，按照相应的体积比例，在其中加入占比各异的伪品DNA，将其视为模板；其次，辅以这种技术经过凝胶电泳后，使用软件对结果中的条带强弱进行分析， 最终得出掺伪量。

4.2 RAPD 技术（随机扩增多态性DNA 技术）

这项技术操作起来十分便捷， 不仅可以采用多态性的方式对未知序列的基因组进行分析， 还可以对DNA 分子进行标记。 该技术借助随机引物扩增，能找到许多的多态性DNA 片段用作标记，弥补RFLP技术的缺陷，对其不能及时发现的重复顺序进行标记，进而补偿其图谱中的缺失。当这项技术应用于中药检验时，可以对动植物类的生药材进行代替品、易混物的检验。不过，这项技术的缺陷在于拥有较弱的重复性与稳定性，这也导致了它在应用时的局限性。人们可以提取较高质量的DNA 基因组，用以规避扩增多态DNA 技术所带来的缺陷，对引起RAPD 的反应因素进行改善，从而保证整体的稳定性。例如，通过对3 种不同种类的麦冬DNA 基因组进行RAPD分析，然后针对其中的特异性分子进行特殊标记[2]，再对这些标记进行克隆与测序，以期发现导致3 种麦冬有所差异的特异性PCR 引物，最终完成特异性检验[3]。

4.3 位点特异性PCR技术

这种技术别名扩增阻滞突变系统， 是一种以单核苷酸多态性（SNP）位点为基础的基因分型法，这种方法的显著特征在于通过单个PCR 反应即可检测真伪，操作过程十分快速。 黎洁文[4]首创了何首乌位点特异性PCR 的分子鉴别法， 具体操作流程是：（1）对何首乌、何首乌近缘种和混淆品ITS2 序列进行变异分析，从中寻找表现出稳定差异的变异位点，以此为背景，设立特异性引物；（2）确定引起PCR 反应的各项因素；（3）使用平板凝胶电泳，并且突破性地采用了毛细管凝胶电泳检测特异性PCR 的扩增产物。

4.4 ISSR 技术（分子标记技术）

这种技术属于新型的分子标记技术，也被称为锚定简单序列重复技术，其特征在于重复性好、具有较高的多态性。虽然此技术的发展时间较短，但是却在中药检验方面得到了大量的推广。 该项技术将锚定微卫星DNA 看作引物，在使用PCR技术时，锚定引物可以使特定位点退火， 以使与其互补间隔较近的重复序列间DNA 片段得以实现PCR 扩增。 相关人员可以借助ISSR 技术对鸡血藤及其混伪品进行检验[5]，流程是：选出5 条ISSR 随机引物，然后扩增鸡血藤和混伪品的重复序列间DNA 片段，此时二者的DNA 指纹图谱显现出了较多不同，可以以此作为检测结果的依据， 这种方法也实现了鸡血藤的分子水平级检测。 除此之外，通过多项实验也可以发现，ISSR 技术在检验中的遗传变异灵敏度方面明显优于RAPD 技术[6]。因此，ISSR 技术更适合分析不同居群鸡血藤的遗传多样性。

5 PCR技术在中药检验中的缺陷

（1）分子生物难以被肉眼所见，所以需要以大量的实验为基础，以此完成方法可行性实验。在此过程中，还要对实验进行不断优化，并且，相关工作人员须具备过硬的专业技术。 （2）中药的产地较多，种植方法有所差异；另外，在栽培时还可能会出现变异等特殊情况。 以上种种因素都会对标记法的重现性与稳定性造成影响，所以，将PCR技术用于实际检验前，需要借助大量实验品作为理论验证基础。 （3）中药检验行业的未来发展特点是快速、简便、精准，但现今所使用的多数分子标记法仍以提取中药DNA、进行PCR 扩增以及电泳检测等步骤为前提，耗时较长，难以适应中药检验的未来发展趋势。（4）某些中药可能会存在次生代谢产物，进而对DNA 的提取造成影响，或者某些经过炮制的中药，同样也会不利于DNA 的提取。

6 PCR技术在中药检验方面的未来展望

伴随着科技的不断发展，分子生物学凭借自身应用范围广泛、多样化的研究方向等优势，拥有着巨大的发展潜力。并且，这项技术在药品检验领域中已经得到了较多应用，现在已经有许多以PCR 为基础的技术应用于中药检验之中。与此同时，人们也应努力改善上文所述的缺陷，以期推进PCR技术在中药检验领域的发展。

7 结语

综上所述，中药对维护人们身体健康发挥着不容小觑的作用，但中药市场还存在着售假以及药材质量各不相同的情况，应依据中药的不同特性选取不同方法进行检验。