microRNAs在骨折愈合过程中对成骨细胞的作用

李晨 王铁军 谭磊 谷峰 夏永宁 张西正 朱东

(吉林大学第一医院创伤骨科，吉林 长春 130021)

老年人骨质相对青壮年人更加脆弱，因而在摔伤或交通事故等意外伤害事件中老年人更易受到外力作用而造成骨折。随着对microRNAs(miR)进行的研究越来越深入，miR对细胞生长与分化的调控作用也越来越受关注。miR在骨代谢中所起到的作用是其中的一个热点。

1 骨折的愈合

骨折的愈合是一个连续的过程，而且愈合过程非常复杂〔1〕，一般认为骨折愈合包含三个阶段：血肿炎症机化期，原始骨痂形成期，骨板形成塑形期，但这三个阶段之间的界限并不完全明确，而是互相包含，逐步推进。在这个过程中，成骨细胞与破骨细胞的协同作用非常重要，成骨细胞的主要作用是合成骨基质，破骨细胞则是吸收骨基质。这两种细胞的相互作用，使骨的生成和吸收达到动态的平衡，从而保证骨折朝着愈合方向进展。国内外大量研究表明多种miR在成骨细胞的分化及增殖中起到重要调控作用从而影响骨折的愈合。

2 miR的发现、生成及作用机制

miR是在真核生物中发现的一类长度为20～24个核苷酸的内源性具有调控功能的非编码RNA。自miR于1993年由Lee等〔2〕发现以来，人们对miR进行了深入的研究。发现miR于细胞内起到了多种非常重要的调节作用。一方面，每一个miR有多个目标基因，另一方面，几个miR也能够作用于同一个基因。据推测，miR调节着人类三分之一的基因。miR最早于细胞核内开始产生，miR基因首先被RNA聚合酶转录，产生一种茎环结构，称为初始miR(pri-miR),在细胞核中通过多蛋白复合物的加工以产生更短的pri-miR结构。然后精确加工的pri-miR将通过Exportin 5(一种存在于细胞核中的miR运输蛋白)输出到细胞核外，并加载到含有核糖核酸酶Ⅲ酶Dicer蛋白，Argonaute蛋白和其他辅助细胞因子的另一台加工机器上。Dicer将介导pri-miR的切割以形成更加成熟的miR，然后该miR将被Argonaute蛋白结合形成沉默复合体(RISC)，其能够通过序列互补性调节蛋白表达到mRNA的3′非翻译区(UTR)的特定区域以调控特定的蛋白质表达〔3〕。

3 部分与成骨细胞相关的miR在骨折愈合过程中的作用及机制

3.1miR-29与成骨细胞 Oskowitz等〔4〕研究表明，在人间充质干细胞(hMSC)分化期间miR的检测鉴定了19个在成骨分化期间上调的miR。miR-29家族在人类存在于1号染色体和7号染色体，主要包括miR-29a、miR-29b和miR-29c。其中miR-29a位于7号染色体(7q32),miR-29b位于7q32和1号染色体(1q32),miR-29c位于1q32〔5〕。研究表明miR-29通过多个途径影响成骨。miR-29a对于成骨细胞形成的影响是通过一个正反馈调节Wnt信号传导通路来进行的：一方面，经典的Wnt通路可以刺激miR-29的表达，另外一方面，miR-29 作用于Wnt通路的抑制因子:Dickkopf相关蛋白(DKK)1、Kremen和Wnt拮抗因子分泌型Frizzled 相关蛋白(SFRP)2，从而进一步促进Wnt信号通路活性和成骨细胞分化〔6〕。研究发现miR-29b通过几种途径影响成骨细胞的分化。一方面，miR-29b通过结合其mRNA中的靶3′-UTR序列降低已知的成骨细胞分化抑制剂如组蛋白去乙酰化酶(HDAC)4，转化生长因子(TGF)β3，激活素A受体(ACVR)2A，β-catenin相互作用蛋白(CTNNBIP)1和双特异性蛋白磷酸酶(DUSP)2蛋白的表达来促进成骨。另一方面，miR-29b减弱了编码骨细胞外基质必需蛋白的胶原基因的表达，从而促进矿物沉积〔7〕。miR-29c通过靶向调节蓬乱蛋白(Dvl)2间接促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨分化、矿化能力〔8〕。

3.2miR-138与成骨细胞 研究表明，miR-138通过影响在促进成骨细胞分化中起重要作用的黏着斑激酶，调节hMSC的成骨分化。miR-138在hMSC的成骨细胞分化期间下调。miR-138的过表达在体外可以降低hMSCs的成骨细胞分化，而抗miR-138对miR-138功能的抑制促进了成骨细胞特异性基因的表达、碱性磷酸酶(ALP)的活性和基质的矿物质化。此外，miR-138的过表达使体内异位骨形成减少了85%，相反，当miR-138被拮抗时，体内骨形成增强了60%。以上研究可以说明，miR-138在成骨过程中起负性调节的作用〔9〕。

3.3miR通过作用于runt相关转录因子(RUNX)2影响骨折愈合 RUNX2已经被许多研究证明为成骨细胞分化所必需，并在成骨细胞分化中起重要的调控作用。其在成骨细胞的分化中受到许多上游miR调控的同时，又同时调控许多下游miR。构成一个以RUNX2为核心的调控网络。研究表明〔10～14〕，在这个调控网络中，miR-23a～27a、miR-204/211、miR-2861、miR-146a、miRNA-20b等都通过作用RUNX2从而参与细胞成骨及骨折愈合。

3.4其他与成骨细胞相关的miR 研究表明miR-335-5p通过下调DKK1激活Wnt信号传导并促进成骨分化〔15〕。有研究表明，miR-125b对于hBMSCs的成骨分化的调节是通过调节Osx表达来进行的〔16〕。Li等〔17〕研究表明，通过在骨形蛋白态发生(BMP)2诱导的间充质细胞的成骨过程中分析miR，25个响应于BMP2显著改变的miR中的22个被下调。其中miR-133和 miR-135在成骨分化过程中起到重要作用。王海鹏等〔18〕研究表明miR-30a-5p对于MSCs向成骨细胞的分化具有促进作用。

Mizuno等〔19〕将外源miR-125b转染进了ST2细胞后，观察到细胞增殖的抑制和成骨细胞分化的抑制。而当向细胞内转染miR-125b抑制剂时，结果显示细胞内的ALP活性升高，由此说明了细胞的成骨分化能力得到了促进。以此证明了miR-125b通过对细胞增殖的影响参与成骨细胞分化。Itoh等〔20〕的研究证明miR-141和miR-200a通过作用于Dlx5并调节Dlx5的表达参与前成骨细胞分化。

国内有学者研究证明，miR-144能够对MSCs的成骨分化产生抑制作用，相反的miR-451则对成骨分化过程有促进作用〔21〕。Hu等〔22〕研究证明了miR-132-3p可降低Ep300蛋白表达抑制成骨细胞分化。Wei等〔23〕研究表明，在miR-654-5p过表达的hBMSCs中BMP2 mRNA和蛋白表达下调,并且miR-654-5p可通过与特定靶位点结合直接抑制BMP2的mRNA和蛋白表达从而抑制成骨细胞的分化。Kureel等〔24〕研究发现miR-542-3p通过作用于BMP-7抑制成骨细胞分化。Guo等〔25〕研究表明miR-17-92a通过调节Bim在雌激素中的表达在成骨细胞抗凋亡过程中发挥重要作用。

4 总结及展望

综上，miR通过多个途径对于成骨细胞的增殖及分化起重要的调控作用从而影响骨折愈合。对miR施加影响来促进成骨细胞的分化及表达从而加速和促进骨折的愈合将成为以后研究方向，从而为老年患者的骨折治疗寻找一种新的方法。