紫外分光光度法测定羊胎盘胶囊中总甙的标准不确定度

赵娟

（宁夏回族自治区食品检测研究院，宁夏银川 750001）

甙亦称为苷，是一种广泛存在于植物中的化合物，其中淫羊藿苷是黄酮类化合物含量最高的淫羊藿单体分离化合物[1]。淫羊藿苷具有抗衰老、抗氧化、抗抑郁等药理作用，在妇科疾病方面也有潜在的价值[2]，羊胎盘胶囊是为女性研制的有抗衰老，抗色斑功效的保健食品，目前，紫外分光光度法是测定羊胎盘胶囊中总甙含量的地方标准方法。该方法于2017年发布，2018年实施。本试验以研究紫外分光光度法测定羊胎盘胶囊中的总甙为例子，依据标准JJF10591.1-2012《测量不确定度评定与表示》[3]，列出总甙计算公式为数学模型，对本实验全部实验过程中所引入的不确定度的分量，逐个进行测量以及评定，为最终标准不确定度的评定提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 实验用设备、溶液、试剂

紫外分光光度计（日本岛津）；BS224电子天平（赛多利斯科学仪器公司）；高速离心机（黑龙江龙泽科技发展有限公司）；超声振荡器（昆山市超声仪器有限公司）。

淫羊藿苷对照品溶液，购自：中国药品生物制品检定所；羊胎盘胶囊，购自宁夏自然生物科技有限公司；甲醇（分析纯）；无水乙醇（分析纯）；乙醚（分析纯）；实验过程所用水均为RO水。

1.2 标准溶液的配制

精密称取经五氧化二磷干燥器或减压干燥24h的淫羊藿苷对照品10mg，用甲醇溶解定容至10.0mL，即得每毫升含淫羊藿苷1.0mg标准溶液，吸取上述对照品溶液1.0mL，用甲醇定容至10.0 mL，即得0.1mg/mL淫羊藿苷对照品的使用液。精密吸取淫羊藿苷对照品使用液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、3.5mL和4.0mL分别至于10mL容量瓶中，以70%乙醇，定容。则标准曲线绝对含量分别为0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.35 mg和0.40 mg。摇匀后用紫外分光光度计在270 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。

1.3 实验方法

取试样至少30粒（约1 g/粒）的内容物于干净容器中，混匀后待测。准确称取混匀后的试样0.50 g，置于50 mL离心管中，加入20 mL乙醚振摇3 min。4 000 r/min离心5 min，弃去上层乙醚，如此反复3次除去干扰杂质；挥干试样中的乙醚后，加入50 mL70%乙醇放入超声波震荡器中震荡提取40 min，冷却后定容至50.0 mL过滤。吸取滤液1.0 mL用70%乙醇定容至10.0 mL，摇匀，即得试液。取上述试液在270 nm波长处测定其吸光度，以70%乙醇为空白对照测定。

1.4 数学模型的建立

羊胎盘胶囊中总甙含量的测定根据DB64/T1515-2017《羊胎盘胶囊中总甙含量测定 紫外分光光度法》：

式中：X为试样中总甙（以淫羊藿甙计）含量，g/100 g；C为试样供试品从标准曲线中查得的含量，mg；m为试样质量，g。

1.5 产生不确定度的各个分量

有多个因素随机影响羊胎盘胶囊中总甙含量，主要包括以下两个方面。（1）紫外分光光度计与定容体积的随机系统性误差、天平的稳定性、样品制备中的均匀度、实验个体的差别、实验环境的改变以及回收率的不确定性等因素所引入的测量不确定度。（2）称量淫羊藿苷对照品、标准溶液的稀释和定容、测定样品总甙含量（随机变化）的重复性及曲线的不确定度等因素所引入的测量不确定度。

2 结果与分析

2.1 标准对照品溶液不确定度

2.1.1 称量过程引入的不确定度

标准对照品的称样量为0.01 g，标准中天平要求的最小分度为0.01 g。标准JJG 1036-2008《电子天平检定规程》中规定，此精度的天平在-10～50 000 mg范围称量，其MPE为±0.5e(e=1.0 mg)，两次称量：空瓶mtare、样品msamp，所得为对照品质量，线性MPE（天平）为矩形分布[4]，天平称量中两次的MPE引入的不确定度

得到：

2.1.2 溶液定容体积所引入的不确定度

定容体积为10 mL，定容于10 mL容量瓶中，10 mL容量瓶（单标线）的允许误差为±0.020 mL，假定其为三角分布，则校准过程中导致的标准不确定度：

2.1.3 稀释过程引入的不确定度

用5 mL的单标线吸管吸取5.0 mL 1.0 mg/mL对照品溶液于50 mL容量瓶中,用甲醇稀释定容，此溶液为淫羊藿苷对照品使用液，浓度0.1 mg/mL。再用5 mL分度吸管吸取淫羊藿苷对照品使用液0.5、1.0、2.0、3.0、3.5 mL 和 4.0 mL，定容至 10 mL，则标准曲线绝对含量分别为0.05、0.10、0.20、0.30、0.35 mg和 0.40 mg。

标准溶液配置的过程中所使用的玻璃量具，以JJC 196-2006《常用玻璃量具检定规程》中要求的最大允差，以三角分布，k= 6，由此推出相对不确定度的各个分量[5]，见表1。

由上述数据合成的相对标准不确定度uCrel：

表1 标准溶液曲线配制中所使用的量具校准引入的不确定度

2.1.4 标准物质引入的不确定度

2.2 得出的样品质量浓度时引入的不确定度（标准曲线校准以最小二乘法拟合）

淫羊藿苷对照品使用溶液标准系列，用紫外分光光度计测定得到相应的吸光度A，进行拟合（最小二乘法），得到其直线方程y=ax+b(a：斜率，b：截距)和标准曲线相关系数（r），见表2。

表2 最小二乘法拟合荧光强度值结果

本实验过程进行了10次样品测定液的平行测定，淫羊藿苷对照品使用溶液的平均质量浓度由直线方程求为X0=0.279 mg，则X0的标准不确定度

n为淫羊藿苷对照品使用溶液的测量次数，本例为18；

p为X0的测量次数，本例为10次。

2.3 样品制备过程引入的不确定度

2.3.1 取样

本实验依照DB 64/T1515-2017《羊胎盘胶囊中总甙含量测定 紫外分光光度法》测定羊胎盘胶囊中总甙含量规定，随机称取充分混匀后的羊胎盘胶囊，我们认为样品是在均匀、有充分代表性的情况下称量，由此所引入的不确定度可以忽略不计。

2.3.2 称重

用最小分度0.1 mg的电子天平称取混匀后的样品0.50 g，根据JJG 1036-2008《电子天平检定规程》中的规定，该精度的天平在-10～50 000 mg称量范围,其MPE：±0.5e(e=1.0 mg)，两次称量：空瓶mtare、样品msamp，所得为样品质量， 线性MPE（天平）为矩形分布，天平称量中两次的MPE引入的不确定度

2.3.3 定容体积所引入的标准不确定度

定容体积为10 mL，定容于10 mL容量瓶中，10 mL容量瓶（单标线）的允许误差：±0.020 mL，假定其为三角分布，则校准过程中导致的标准不确定度：

2.3.4 样品制备过程引入的不确定度

2.4 本实验所测量的重复性的相对标准不确定度

在实验重复性条件的前提下，对羊胎盘胶囊中总甙含量进行10次独立性实验测试，其测量所得数据见表3。

表3 羊胎盘胶囊总甙含量独立测定10次实验数据

10次测定总甙含量（重复性条件下），其算数平均值为：

单次测量的标准偏差为：

3 所引入的不确定度分量

各不确定度分量见表4。

表4 羊胎盘胶囊总甙含量不确定度分量

4 合成标准不确定度

5 扩展不确定度

取包含因子k=2，被测量之值的大于95%可包含于此区间。则扩展不确定度：U(Y)=k×Uc(Y)=2×5.66=11.4 g/100 g，相对扩展不确定度：Urel(Y)=U(Y)/96.4×100%=11.8%

则用紫外分光光度法测定羊胎盘胶囊中总甙含量，对两份样品平行测定取平均值()的报告，扩展不确定度：（96.4±11.4）mg/kg，k（包含因子）=2，相对扩展不确定度：11.8%

6 结论

本试验采用紫外分光光度法测定羊胎盘胶囊中总甙的含量，对标准物质的称量、标准溶液的配制、标准曲线的拟合、测量的重复性等要素所引入的不确定度等因素的不确定度评定，得出紫外分光光度法测定羊胎盘胶囊中总甙含量方法扩展不确定度：（96.4±11.4）mg/kg，k（包含因子）=2。其中标准溶液的校准、样品制备的过程、曲线最小二乘法拟合对不确定度影响比较大，在以后的试验操作中可通过对样品充分混匀，增加实验测定的次数等方法来减少引入的不确定度。