柑桔黄龙病菌亚洲种菌毛形成蛋白基因序列分析、原核表达及抗血清制备

余乃通 ，李宾宾，2，黎维丽，2，杨 毅 ，刘志昕

（1. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所/海南省微生物学重点实验室/农业农村部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 海口 571101；2. 海南大学热带农林学院, 海南 海口 570228；3. 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所， 海南 海口 571101）

柑桔黄龙病（Citrus Huanglongbing, HLB）是柑桔类作物一种毁灭性病害，严重威胁着世界各地柑桔类作物主产区的生产［1-2］。目前该病害已相继在亚洲、非洲、大洋洲和美洲的50多个国家和地区报道，引起柑桔产业的巨大经济损失［1，3］。在我国19个柑桔主产区中，已有11个遭受到HLB危害［4-5］。柑桔黄龙病的病原是一种专性寄生于植物韧皮部的革兰氏阴性菌，属韧皮部杆菌属（CandidatusLiberibacter），目前有3个种，即亚洲种（CandidatusLiberibacter asiaticus）、非洲种（CandidatusLiberibacter africanus）和美洲种（CandidatusLiberibacter americanus）［6］，主要由亚洲柑桔木虱（Diaphorina citri）和非洲柑桔木虱（Trioza erytreae）传播［7］。

近年来，随着海南绿橙等柑桔类产业的快速发展，柑桔黄龙病也随之而来和快速传播［8］。前期，我们从感染HLB的海南绿橙中筛选出表达量较高的1个分泌蛋白，菌毛形成蛋白（Pilus formation protein，408），与菌毛组装相关［9］。革兰氏阴性菌含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ类等8个不同类型的蛋白分泌系统［10］。研究表明，细菌分泌蛋白对病原菌感染宿主和引起宿主病变等方面起到重要作用［11-13］。柑桔黄龙病菌含有完整的Ⅰ类蛋白分泌系统和不完整的Ⅲ类和Ⅳ类蛋白分泌系统［14］。

本研究从感染HLB的海南绿橙中扩增出408蛋白基因，序列分析表明，408基因与柑桔黄龙病菌亚洲种psy62 株系（GenBank登录号：CP001677.5）的408基因序列一致［15］。对该蛋白进行原核表达及抗血清制备，得到了特异性强的408抗血清，工作效价在1∶500～1∶10 000之间。本研究制备的408多抗血清为408蛋白的功能研究和柑桔黄龙病菌的蛋白检测产品开发提供重要基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

感染柑桔黄龙病的绿橙叶片采自海南省琼海市，-80℃保存；pET32a载体由本实验室保存；E. coliBL21 （DE3）菌株购自北京全式金生物技术有限公司；EcoRⅤ和XhoⅠ均购自大连宝生物公司；HSTMMIX购自东盛生物公司；植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；BCIP/NBT底物显色试剂盒、氨苄青霉素（Ampicillin）、Isopropyl β-D-Thiogalactoside（IPTG）、丙烯酰胺、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自Solarbio公司；十二烷基硫酸钠（SDS）、甘氨酸、考马斯亮蓝R-250均购自海南爱斯科坦生物公司；PCR产物回收试剂盒购自OMEGA公司；碱性磷酸酯酶（AP）标记山羊抗小鼠IgG购自Biosharp生物公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG购自碧云天生物技术公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 根据柑桔黄龙病菌408分泌蛋白基因（GenBank登录号：CP001677.5）编码区核苷酸序列和pET32a载体多克隆酶切位点设计1对特异性引物，408-F （5’-CCG GAT ATC TTG CAT CGT AAG CGC CAA AGA G-3’，下划线为EcoRⅤ酶切位点）和408-R （5’-CCGTCC TGA CGG GAG GAG AGG AGG-3’，下划线为XhoⅠ酶切位点），由深圳华大基因股份有限公司（BGI）合成。

1.2.2 总DNA的提取及408基因的克隆 以感染HLB的绿橙叶片为材料，参照天根植物基因组DNA提取试剂盒操作说明进行总DNA的提取，用408-F和 408-R引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为：DNA模板2 μL，正反引物各 2 μL（10 μmol/L），dNTPs 4 μL，5×TaqBuffer 10 μL，TaqDNA polymerase 1 μL，加ddH2O到50 μL。PCR程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35个循环；72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 pET32a-408表达载体的构建 利用OMEGA公司的胶回收试剂盒对408目的基因进行回收，对回收的408基因产物和pET32a载体进行EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切，经T4DNA连接酶将408基因连接到pET32a载体上，转化大肠杆菌DH 5α菌株，涂布于含50 μg/mL氨苄（Amp）抗性的固体LB平板上，37℃培养箱过夜培养进行抗性筛选。挑取平板上的单克隆菌落，利用408-F和 408-R引物进行菌液PCR鉴定，随机选取3个大小正确的单克隆菌落送往赛默飞世尔科技（中国）有限公司进行双向测序。对测序正确的单克隆菌落提取重组载体，进行双酶切验证。将经过测序和双酶切验证的重组载体命名为pET32a-408。

1.2.4 408蛋白的诱导表达及可溶性分析 对测序正确的重组载体转化E .coliBL21 （DE3）菌株，挑取平板上的单克隆菌落接种到液体LB培养基（含100 μg/mL的Amp），37℃于200 r/min培养过夜。以1∶50的比例将过夜培养的菌液接种到150 mL液体LB培养基中（含100 μg/mL的Amp），37℃、200 r/min继续培养，期间取样测菌液OD600值，待菌液OD600达到0.6～1.0，加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L，继续培养6 h。菌液于12 000 r/min离心，收集沉淀，溶于15 mL的1×PBS缓冲液中，超声波破碎20 min（连续循环工作4 s，停止8 s）；12 000 r/min 离心5 min，分别取上清和沉淀（溶于8 mol/L尿素的15 mL Lysis buffer）10 μL与等量体积的2×SDS loading buffer混合后，100℃煮沸10 min，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳（90 V, 2 h）。

1.2.5 融合蛋白的纯化 用含8 mol/L尿素的15 mL Lysis buffer溶解超声波破碎后的沉淀，8 000 r/min离心除去不溶性物质，上清过0.45 μm滤膜，然后通过Ni2+-NTA亲和层析柱进行纯化，经washing buffer溶液洗去杂蛋白后，用不同浓度的咪唑（50、100、150、200、250 mmol/L）洗脱液进行洗脱，于12% SDS-PAGE凝胶电泳检测。将纯化后的蛋白于-20℃保存。

1.2.6 抗血清的制备 取纯化后溶于150 mmol/L咪唑的408蛋白溶液20 μL与80 μL 1×PBS缓冲液混合，再与100 μL的弗氏不完全佐剂混匀，腹腔免疫小白鼠；而后每隔7 d再次腹腔免疫小白鼠4次（使用弗氏完全佐剂）。最后一次免疫4 d后，对小白鼠进行眼球取血，室温放置30 min后，于4℃静置过夜。5 000 r/min离心10 min，取上层血清，分装后于-80℃保存。同时，使用1×PBS缓冲液作为对照免疫小白鼠，即对照血清。

1.2.7 抗体效价检测及特异性检测 使用间接ELISA法测定408多抗血清的效价［16］。将获得408多抗血清分别按1∶500、1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶50 000、1∶100 000的比例进行稀释。将纯化后的408蛋白（用包被液1∶1 000稀释）100 μL加入到96孔板中，37℃孵育2 h；1×PBST缓冲液洗涤3次后，加入200 μL的1%BSA封闭液，37℃封闭2 h；重复洗涤3次后，加入100 μL稀释后的血清，37℃孵育1 h；重复洗涤3次后，加入100 μL HRP标记的羊抗小鼠IgG（1∶3 000），37℃孵育30 min；重复洗涤3次后，加入100 μL TMB底物显色液，避光条件显色15 min后，加入50 μL的浓盐酸终止反应，使用酶标仪测定OD450的值。

取纯化后溶于150 mmol/L咪唑的408蛋白溶液20 μL与等量体积的2×SDS loading buffer混合，100℃煮沸10 min变性，于12%的SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结束后，将蛋白凝胶和硝酸纤维素膜（NC膜）预先用转膜液浸泡5 min，放入半干转膜仪中，电流1A转膜25 min。转膜完成后用1×TBST缓冲液清洗NC膜3次；5%脱脂奶粉封闭液进行封闭2 h；1×TBST缓冲液清洗3次后，置于408多抗血清（1∶1 000）孵育1 h；1×TBST缓冲液清洗3次后，置于碱性磷酸酯酶（AP）标记山羊抗小鼠IgG稀释液（1∶2 000）孵育30 min；1×TBST缓冲液清洗3次后，使用BCIP/NBT显色试剂盒显色，拍照保存。

2 结果与分析

2.1 408基因的克隆及其序列分析

以HLB感染的绿橙总DNA为模板，进行PCR扩增，电泳结果见图1A，在250～500 bp之间有一条特异性DNA条带，大小为400 bp左右，与目的基因大小一致。测序结果经NCBI blastn分析表明，该基因为柑桔黄龙病菌的408分泌蛋白基因，与Duan等报道的柑桔黄龙病菌亚洲种psy62 株系（GenBank登录号：CP001677.5）的408基因序列一致［15］，大小为408 bp，编码135个氨基酸，分子量大小为14.95 ku。

图1 408基因扩增及pET32a-408质粒酶切验证

图2 柑桔黄龙病菌408同源蛋白的多重序列比对

氨基酸比对分析表明，海南柑桔黄龙病菌408蛋白与柑桔黄龙病菌亚洲种的408蛋白同源性为69.7%～100%；与马铃薯斑纹病菌（CandidatusLiberibacter solanacearum）的408蛋白同源性在35.2%～48.9%。NCBI保守结构域（NCBI conserved domain）预测分析表明，本研究获得的408蛋白含有1个高度可信的菌毛形成蛋白N端结构域（Pilus formation protein N terminal domain），以及C端含有两个高度保守的基序，Motif 1和Motif 2；对菌毛形成蛋白N端结构域进行同源比较，结果表明，本研究获得的408蛋白其菌毛形成蛋白N端结构域与其他柑桔黄龙病菌亚洲种408蛋白的该结构域同源性均为100%，而与马铃薯斑纹病菌408蛋白的该结构域同源性为60.2%～63%，说明该结构域具有高度保守的种属特异性（图2）。

2.2 原核表达载体的构建

测序结果表明，3个单克隆菌中的408基因插入片段大小正确，碱基无缺失、突变发生，且编码框无移位。双酶切验证如图1B所示，特异性获得酶切后的408基因和pET32a载体片段。将经过测序和双酶切验证的重组载体命名为pET32a-408，作为后续原核表达的重组质粒。

2.3 408蛋白的原核表达及可溶性分析

将pET32a-408重组载体转化BL21 （DE3）表达菌，挑取转化平板上的单克隆菌落接种到含氨苄抗性的LB液体培养基进行诱导表达，分离上清和沉淀进行可溶性分析。12% SDSPAGE凝胶电泳表明，与未诱导的重组菌相比，经1 mmol/L IPTG诱导6 h后的重组菌在分子量大小约34 ku处，出现一条清晰的蛋白条带（图3A），与预测的408融合蛋白33.82 ku大小基本一致，即408融合蛋白。可溶性分析结果表明，408融合蛋白主要以沉淀形式（包涵体）表达（图3B）。

图3 408融合蛋白的原核表达及可溶性分析

2.4 融合蛋白纯化

由于408融合蛋白含有His标签，可经过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化。将含有408融合蛋白的包涵体沉淀溶解，用不同咪唑浓度的洗脱液洗脱纯化，最后用SDS×PAGE分析该蛋白在不同咪唑浓度洗脱液中的分布情况，结果见图4，经100 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱后，Ni2+-NTA亲和层析柱上的杂蛋白可除去大部分；再经150 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱后，大部分408融合蛋白从Ni2+-NTA亲和层析柱中洗脱下来，而在200、250 mmol/L咪唑的洗脱液中分布很少。由此可见，经不同咪唑浓度的洗脱液洗脱后，408融合蛋白主要在150 mmol/L咪唑的洗脱液中分布，于-20℃保存，备用。

图4 不同浓度咪唑溶液对408融合蛋白的洗脱

2.5 408多抗血清效价及特异性

对408多抗血清进行不同比例稀释，以纯化后的408融合蛋白（1∶1 000稀释）为抗原，通过ELISA方法对408多抗血清进行效价测定。结果分析表明，与对照血清相比，408多抗血清在稀释 500、1 000、5 000、10 000倍时，408多抗血清呈明显的阳性反应（判断标准为408 PcAb的OD450值/PBS PcAb的OD450值＞2.1）；而408多抗血清在稀释10 000倍以上均不能很好地呈阳性反应（图5）。Western blotting结果分析表明，408多抗血清能与纯化后的融合蛋白起特异性反应，无其他明显杂带（图6）。

图5 408多抗血清效价检测

图6 Western blot检测408抗体的特异性

3 结论与讨论

前期，我们通过PCR、qPCR和RT-qPCR的方法从感染HLB的海南绿橙样品中筛选出1个表达量高的柑桔黄龙病菌分泌蛋白408，参与菌毛的组装。将408蛋白基因构建到GV1300植物双向表达载体，通过农杆菌注射烟草进行瞬时表达，共聚焦显微镜观察表明，在烟草细胞的细胞核和细胞质种观察到绿色荧光，说明408蛋白定位于烟草细胞的细胞核和细胞质中［9］。序列分析表明，408蛋白除了含有菌毛形成蛋白N端结构域外，其C端还含有两个高度保守的基序，Motif 1和Motif 2。这两个高度保守的基序可能与其在宿主细胞的功能相关，调控宿主的相关代谢或重要通路。但是，408蛋白在宿主体内具体的功能和机理有待进一步研究。

目前，柑桔黄龙病的有效检测方法包括PCR［17］、环介导等温扩增技术（LAMP）［18］、荧光定量PCR［19］、重组酶聚合酶扩增方法（RPA）［20］等诊断技术。虽然柑桔黄龙病菌相关蛋白基因的单克隆和多克隆制备也已报道［14，21-23］，但是目前尚无商业化的蛋白检测产品。408蛋白是柑桔黄龙病菌的分泌蛋白，是菌毛蛋白的重要组成成分，因此，它的含量是病菌含量的几千倍甚至是几万倍以上。另外，我们通过对408蛋白的免疫原性分析发现，其N端到C端的免疫原性较好。本研究不但丰富了制备HLB蛋白检测产品的选择，同时使用该蛋白制备的单克隆抗体或多克隆抗体产品具有更高的效价和灵敏度。

柑桔黄龙病病菌根据病原的传播媒介、序列特征和热敏性等可分为亚洲种、非洲种和美洲种。根据408蛋白基因的序列分析，感染海南绿橙的黄龙病菌为亚洲种，与我国其他地区柑桔类作物上报道的黄龙病菌属于同一个种［24］。因此，使用本研究制备的抗体不但能用于海南绿橙黄龙病的检测，也可用于我国其他柑桔类黄龙病的检测。