胎盘组织内多环芳烃浓度与唇腭裂风险的关联性研究

乔怡然 倪文丽 孙颖 王斌 靳蕾 李智文 王琳琳 任爱国

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一类由2个或2个以上苯环以稠环方式形成的化合物，主要来自于化石燃料(如煤炭、石油)和生物质(如木材、烟草、秸秆)的不完全燃烧。PAHs在环境中分布广泛，主要通过呼吸道和消化道进入人体。大量研究显示，PAHs具有广泛的不良健康效应，如增加肿瘤发生风险、造成不良妊娠结局等[1,2]。唇腭裂(orofacial clefts)是发生于胚胎发育第4～12周的先天性口面部畸形。2011年我国围产期出生缺陷监测数据显示，总唇裂出生患病率为11.43/万，仅次于先天性心脏病和多指(趾)，位居第三[3]。美国一项针对PAHs职业暴露的病例对照研究发现，唇裂(伴或不伴腭裂)患儿母亲PAHs职业暴露水平显著高于对照组，且具有剂量反应关系；而单纯腭裂则不存在这种关联[4]。对山西省四县的研究发现，被动吸烟、燃煤取暖与唇腭裂发生风险存在关联，并且显示出明显的剂量反应趋势[5]。烟草烟雾内含有PAHs、尼古丁、烟焦油等多种有害物质；煤炭燃烧的烟雾中还存在大量粉尘、硫化物、氮氧化物等。基于问卷中有关吸烟或煤炭燃烧的研究无法确定何种物质对后代唇腭裂存在影响。由于胎儿发育所处的宫内环境不直接暴露于外界环境，胎儿与母体通过胎盘屏障存在血液交换且具有个体差异，对孕妇外环境的暴露评估不能有效地评价胎儿的暴露情况。因此选择适宜的生物样品，通过检测内暴露标志物，分析环境暴露与唇腭裂风险之间的关联性更为客观。本研究拟通过检测胎盘组织内PAHs浓度，分析PAHs水平与唇腭裂风险之间的关联性。

对象与方法

一、对象

本研究采用病例对照研究设计，病例为2003-2016年间在山西省六个县/市募集的有胎盘组织标本的所有唇腭裂病例，共103例；从同期募集的有胎盘组织的509例无缺陷新生儿中随机抽取103例作为对照。

纳入条件为：病例为产前诊断引产或足月分娩时诊断的唇腭裂患儿，对照为无任何异常的、非医学原因引产的胎儿或足月新生儿。病例与对照组母亲均为当地常住居民(在当地居住≥2年)，妊娠期间也在本地居住；签署知情同意书，采集胎盘组织标本。本研究获得北京大学生物医学伦理委员会批准。

二、方法

1.问卷调查：调查员为当地妇幼保健院医生，经过统一培训，使用结构式调查表对病例和对照母亲或家属进行面对面调查，内容包括孕妇一般情况、末次月经日期、围孕期(孕前3个月～孕早期)疾病和药物使用、行为习惯、饮食与叶酸增补、环境污染物暴露、出生缺陷家族史、产前诊断、胎儿性别等信息。

2.生物样品采集：研究对象签署知情同意书后，在引产或足月产时收集胎盘组织标本。拭去母亲面浮血，从胎儿面脐根处向外剪取约10 g胎盘组织，超纯水清洗后剪碎，于冻干机中-51 °C，0.035 mbar冻干40 h。

3.仪器及试剂：本研究采用气相色谱-质谱法，检测美国环保署提出的16种优先控制的PAHs。所用仪器为Agilent GC-MS:7890B-5977A，使用电子电离轰击源(Agilent，美国)；DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，弱极性色谱柱，Agilent，美国)。PAHs混合标准品包括：萘(NAP)、苊烯(ANY)、苊(ACE)、芴(FLU)、菲(PHE)、蒽(ANT)、荧蒽(FLO)、芘(PYR)、苯并[a]蒽(BAA)、艹屈(CHR)、苯并[b]荧蒽(BBF)、苯并[k]荧蒽(BKF)、苯并[a]芘(BAP)、茚并[1,2,3-cd]芘(I1P)、二苯并[a,h]蒽(DahA)、苯并[ghi]芘(BghiP)，产自Dr.Ehrenstorfer公司(德国)。PAHs的定量检测使用三种内标分别为苊-D10 (ACE-D10)、蒽-D12 (ANT-D10)和艹屈-D12 (CHR-D12)，使用两种回收率指示物菲-D10 (PHE-D10)和芘-D10 (PYR-D10)，均产自Dr.Ehrenstorfer公司(德国)，平均回收率在80%～120%之间视为有效。

试剂包括：正己烷(HEX，农残级)和硅胶(色谱级，平均孔径60A，0.063-0.100 mm)购于Merck试剂公司；二氯甲烷(DCM，色谱级)购于J.T.Baker公司；无水硫酸钠(分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司；中性氧化铝购于MP Biomedicals公司。凝胶渗透色谱柱型号为CLNpak EV-2000(Shodex，日本)。所有玻璃仪器、铝箔及玻璃纤维滤膜使用前在马弗炉内450 ℃烘烤6 h，无水硫酸钠需650 ℃烘烤6 h。

4.胎盘组织PAHs提取及检测：冻干的胎盘组织置于脂肪提取器中，加入20 ng PAHs回收率指示物(PHE-D10 & PYR-D10)，使用120 ml DCM作为提取液，56 ℃水浴24 h，提取脂肪及目标化合物。提取后将溶剂蒸发至近干，通风橱内敞口静置1 h后称量平底烧瓶和粗脂肪的总重量，总重与平底烧瓶质量之差即为粗脂肪质量。凝胶色谱仪(GPC)对样品进行粗净化，DH11 (DCM:HEX 1:1 v:v)作流动相，流速为5 ml/min，接取9～22 min流出液用于分析PAHs。使用氧化铝-硅胶混合层析柱(内径6 mm)净化样品，装柱填料从下到上依次为氧化铝(6 cm，2%水去活)、硅胶(6 cm,2%水去活)和无水硫酸钠(1 cm)。使用气相色谱-质谱联用仪、电子电离轰击源对特征离子及保留时间进行定性和定量分析。胎盘组织中PAHs的浓度以粗脂肪质量进行调整，表示为ng/g脂肪。对检测含量在定性检出限(LOD)和定量检出限(LOQ)之间的物质，在统计分析时使用1/2 LOQ进行调整。

5.统计学处理：采用SPSS 24.0进行数据处理和分析。通过χ2检验比较唇腭裂病例组和对照组的母亲一般特征。由于目标物质含量不服从正态分布，使用非参数检验比较病例组与对照组之间胎盘组织PAHs浓度的差异。以对照组胎盘组织PAHs中位浓度为界值进行分组，根据文献中可能与唇腭裂发生存在关联的因素进行调整，采用非条件Logistic回归进行多因素分析，获得调整混杂因素后污染物浓度与唇腭裂发病风险之间的关联。PAHs水平与唇腭裂发生风险使用OR值和95%置信区间(95%CI)表示。使用Pearson相关或Spearman相关探究PAHs浓度的影响因素及PAHs浓度与孕周之间的关系。统计分析采用双侧检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。

结 果

一、研究对象一般特征

103例病例(单纯唇裂40例，单纯腭裂6例，唇裂合并腭裂57例)及103例对照的一般特征如表1所示。病例组母亲平均年龄(26.1±4.8)岁，对照组平均年龄(26.5±4.6)岁。将年龄按<25、25～29、30～34及≥35岁分为四组，病例组与对照组年龄分布无统计学差异(P=0.590)。病例组妇女孕前平均BMI为(23.1±4.3)kg/m2，对照组平均BMI为(22.6±3.8)kg/m2，按<18.5、18.5～23.9、≥24.0分为三组，病例组与对照组不同营养状况之间分布无统计学差异(P=0.565)。研究对象的孕周均在19～46周之间，病例组孕妇平均孕周为(36.7±5.6)周，对照组平均孕周为(39.5±2.8)周，以孕37周为界分为两组，病例组与对照组之间平均孕周存在统计学差异(P<0.001)。此外，病例组与对照组相比在胎儿性别方面男性多于女性(P=0.022)；在出生缺陷胎儿生育史、围孕期感冒发热、吸烟/被动吸烟方面病例组高于对照组；在做饭燃料类型分布上病例组更多使用烟煤作为燃料(P=0.001)。病例组与对照组之间母亲职业、受教育程度、孕期是否采暖不存在统计学差异。

表1唇腭裂病例和健康对照的一般特征

Table1Characteristics of demographic and environmental exposure among orofacial cleft cases and controls [n(%)]

CharacteristicControlsCasesMaternal age (years) <2544 (43.1)46 (46.0) 25～2932 (31.4)36 (36.0) 30～3419 (18.6)12 (12.0) ≥357 (6.9)6 (6.0)Body mass index (kg/m2) <18.513 (12.9)10 (10.1) 18.5～23.958 (57.4)53 (53.5) ≥24.030 (29.7)36 (36.4)Occupation Farmer77 (74.8)66 (64.1) Other26 (25.2)37 (35.9)Education Primary or lower4 (3.9)7 (6.8) Junior high60 (58.3)60 (58.3) High school or above39 (37.9)36 (35.0)Gestational week# 19～365 (5.0)24 (24.7) ≥3795 (95.0)73 (75.3)Infant sex* Male46 (46.9)62 (63.3) Female52 (53.1)36 (36.7)History of birth-affected pregnancy* Yes0 (0.0)5 (5.0) No102 (100.0)96 (95.0)Maternal flu or fever in early pregnan-cy# Yes15 (14.7)36 (35.6) No87 (85.3)65 (64.4)Smoking or passive smoking# None68 (66.0)48 (46.6) Sometimes25 (24.3)24 (23.3) Daily10 (9.7)31 (30.1)Primary fuel used for cooking# Coal11 (11.5)31 (30.4) Other85 (88.5)71 (69.6)Conceiving during the heating season Yes51 (52.0)54 (53.5) No47 (48.0)47 (46.5)

*Compared with control group,P<0.05;#Compared with control group,P<0.01

二、胎盘组织PAHs浓度

根据定量检出限进行定量，五环及六环PAHs(BBF、BKF、BAP、I1P、DahA、BghiP)检出率均低于60%，四环PAHs中CHR检出率低于80%。由于五环及六环PAHs定量检出率过低，仅对四环及以下的PAHs进行描述及统计分析(表2)。PAHs浓度不服从正态分布，使用中位数及四分位数(P25～P75)进行描述。从总体来看，低分子量PAHs (L-PAHs)浓度高于高分子量PAHs (H-PAHs)；不论是∑L-PAHs、∑H-PAHs还是∑PAHs，病例组胎盘组织PAHs水平低于对照组，但差异不具有统计学意义。L-PAHs中，病例组NAP水平低于对照组，存在统计学差异(P=0.019)；在H-PAHs中，病例组BAA水平低于对照组，存在统计学差异(P=0.048)。

表2唇腭裂病例组和健康对照组胎盘组织PAHs浓度(ng/g)

Table2Concentrations of PAHs in placental tissues of orofacial cleft cases and controls [Median (P25～P75) ](ng/g lipid)

PAHsControlsCasesL-PAHs NAP#129.4(101.7～153.6)111.1(96.4～136.7) ANY4.2(3.0～5.1)4.3(3.3～4.8) ACE34.0(27.5～41.6)32.9(26.7～38.9) FLU80.6(61.8～94.0)75.8(59.3～92.1) PHE166.3(137.0～221.0)163.8(120.2～227.7) ANT8.8(6.4～11.4)7.7(5.3～10.8)H-PAHs FLO21.2(17.5～26.7)21.8(16.5～25.9) PYR10.3(8.3～12.7)9.5(7.5～12.2) BAA#2.0(1.7～2.6)1.9(1.6～2.3) CHR3.4(2.0～4.4)3.0(1.5～4.2)∑L-PAHs*424.7(363.0～503.2)400.1(335.0～529.6)∑H-PAHs*37.1(30.7～47.3)35.8(28.2～43.8)∑PAHs*468.1(393.5～545.4)441.6(364.5～570.0)

*∑L-PAHs:Sum of NAP,ANY,ACE,FLU,PHE and ANT,∑H-PAHs:Sum of FLO,PYR,BAA and CHR,∑PAHs:Sum of all 10 detectable PAHs above;#Compared with control group,P<0.05.

以对照组胎盘组织PAHs中位浓度为界值分组进行分析，获得粗OR值(crude OR,cOR)及95%CI。调整胎儿性别、孕周分组、孕妇职业、吸烟与被动吸烟、围孕期感冒发热后，使用非条件Logistic回归，分析PAHs与唇腭裂的关联，获得调整后的OR值(adjusted OR,aOR)及95%CI，结果见表3。尽管NAP的cOR值为0.47 (0.26～0.82)，但调整混杂因素后NAP的水平与唇腭裂之间不存在统计学关联(P=0.124)。∑L-PAHs、∑H-PAHs、∑PAHs的aOR值(95%CI)分别为0.74 (0.38～1.44)、1.17 (0.60～2.25)、0.71 (0.37～1.38)，PAHs高暴露与唇腭裂发生风险之间不存在统计学上的关联。

表3胎盘组织PAHs水平与唇腭裂风险的关联

Table3Risk in association with a concentration above the median of PAHs of controls

PAHscOR (95%CI)aOR# (95%CI)L-PAHs NAP0.47 (0.26～0.82) △0.59 (0.30～1.16) ANY1.15 (0.66～1.99)1.06 (0.60～2.24) ACE0.84 (0.48～1.45)0.90 (0.46～1.75) FLU0.74 (0.43～1.29)0.90 (0.46～1.75) PHE0.94 (0.55～1.63)1.04 (0.53～2.06) ANT0.74 (0.43～1.29)0.82 (0.42～1.57)H-PAHs FLO1.10 (0.64～1.91)1.29 (0.66～2.49) PYR0.81 (0.47～1.40)1.08 (0.56～2.09) BAA0.74 (0.43～1.29)0.88 (0.45～1.70) CHR0.69 (0.40～1.19)0.84 (0.44～1.62)∑L-PAHs*0.69 (0.40～1.19)0.74 (0.38～1.44)∑H-PAHs*0.91 (0.52～1.57)1.17 (0.60～2.25)∑PAHs*0.66 (0.38～1.15)0.71 (0.37～1.38)

*∑L-PAHs:Sum of NAP,ANY,ACE,FLU,PHE and ANT,∑H-PAHs:Sum of FLO,PYR,BAA and CHR,∑PAHs:Sum of all 10 detectable PAHs above;#Adjusted for infant sex,gestational week,maternal occupation,smoking and passive smoking and flu or fever during early pregnancy.△P<0.05.

三、PAHs浓度相关因素分析

为进一步研究影响胎盘组织PAHs浓度的相关因素，对母亲职业、胎儿性别、做饭主要燃料、孕期采暖等二分类变量使用Pearson相关分析，对母亲年龄、孕前BMI、孕周等非正态分布的连续变量以及受教育程度、吸烟/被动吸烟等级变量使用Spearman相关分析，分析这些因素对∑L-PAHs、∑H-PAHs、∑PAHs浓度的影响。如表4所示，孕期采暖与∑L-PAHs及∑PAHs升高有关，但与∑H-PAHs不存在相关性(P=0.191)；孕妇职业为农民，其胎盘组织∑H-PAHs浓度较高(P=0.046)。

四、孕周与PAHs浓度的关系

由于对照组标本绝大多来自于足月产胎儿，而部分病例来自产前诊断引产胎儿。因而，如果污染物水平随孕周有较大变化，则会影响研究结论。因对照组孕周分布差异较小，因此仅对病例组分析孕周与胎盘组织PAHs浓度的关系。将孕周按“20～27周”、“28～36周”“≥37周”分为三个等级，使用Spearman等级相关分析∑L-PAHs、∑H-PAHs、∑PAHs的浓度与孕周的关联(表5)。结果发现，胎盘组织内∑L-PAHs、∑H-PAHs、∑PAHs水平随着孕周的增加而升高，差异具有统计学意义(分别为P=0.005、P=0.025和P=0.006)。

表4 研究对象一般特征与PAHs浓度的关系Table 4 Correlation between PAH concentrations and maternal characteristics of demographic and environmental exposure

*Education was coded as:“Primary or lower”-1,“Junior high”-2,“High school or above”-3;#Smoking or passive smoking was coded as:“None”-1,“Sometimes”-2,“Daily”-3;△∑L-PAHs:Sum of NAP,ANY,ACE,FLU,PHE and ANT,∑H-PAHs:Sum of FLO,PYR,BAA and CHR,∑PAHs:Sum of all 10 detectable PAHs above.▲P<0.05.

表5 唇腭裂病例组胎盘组织PAHs浓度(ng/g)与孕周的关系Table 5 Relationship between concentrations (ng/g lipid) of PAHs in placental tissues of orofacial cleft cases and gestational weeks

*∑L-PAHs:Sum of NAP,ANY,ACE,FLU,PHE and ANT,∑H-PAHs:Sum of FLO,PYR,BAA and CHR,∑PAHs:Sum of all 10 detectable PAHs above.#Compared within the age group,P<0.05;△Compared within the age group,P<0.01.

讨论

本研究对胎盘组织内16种目标PAHs进行检测，10种高于定量检出限。唇腭裂病例组和对照组间10种PAHs总浓度中位数的差异无统计学意义；单因素分析时对照组萘(NAP)的浓度显著高于病例组，但调整混杂因素后，这一联系不再存在。按照PAHs分子量分组分析，也未发现病例组和对照组之间差异存在统计学意义。

脂溶性有机污染物PAHs可通过胎盘屏障进入胎儿体内。Yu等[6]对北京地区非吸烟妇女母乳、胎盘组织、脐带血中的PAHs含量进行检测发现，胎盘组织PAHs浓度低于脐带血，但二者PAHs浓度之间存在正相关关系，说明胎盘组织PAHs的浓度能够从一定程度上反映胎儿PAHs的暴露情况。尽管有研究发现脐带血BKF、BAP、DahA水平高于母亲血[7]，表明有机污染物可能在胎儿体内富集，但对孕周较小的病例组较难获取到足够量的脐带血标本，因此胎盘组织是能够获取的与胎儿暴露较为接近的生物样品。

本研究中唇腭裂病例组与对照组中位PAHs浓度分别为441.6 ng/g和468.1 ng/g，与同一项目组对神经管缺陷病例及对照的胎盘组织PAHs浓度检测的中位浓度值(597 ng/g和392 ng/g)[8]相近，低于母亲血清PAHs中位浓度(5 839 ng/g和2 668 ng/g)[9]。对PAHs母婴传递关系的研究均显示，胎盘组织PAHs浓度低于母亲血清PAHs浓度，胎盘组织PAHs浓度低于脐带血PAHs浓度[10,11]。

对于总PAHs浓度，L-PAHs占比较大，而五环及以上PAHs的定量检出率均较低。这种分布情况可能与PAHs暴露来源及人体吸收、代谢有关，也可能与胎盘屏障对不同种类PAHs的阻隔作用不同有关。在Yu等[6]的研究中，胎盘组织PAHs的浓度同样存在L-PAHs占比明显高于H-PAHs的现象。敬烨[12]对上海地区PAHs母婴暴露及传递情况的研究发现，胎盘组织H-PAHs含量明显低于母血及脐血，认为胎盘对H-PAHs的阻隔作用较弱。

在胎盘组织PAHs浓度影响因素的分析中，孕期采暖与∑L-PAHs和∑PAHs浓度成正相关关系。Downward等[13]发现不同种类煤炭燃烧产生的PAHs种类及含量具有差异，贫瘦煤燃烧能够显著增加空气颗粒物中NAP水平。Geng等[14]发现在燃煤产生的PAHs中气相PAHs占95%，NAP占比最大；颗粒相PAHs以三环及四环PAHs为主。本研究发现孕期采暖与∑L-PAHs之间具有显著的正相关关系，可能提示孕期采暖会增加L-PAHs的暴露，且L-PAHs可能主要来自于煤炭的燃烧。

本研究的优势在于研究纳入唇腭裂病例及对照各103例，与其他使用胎盘组织样品进行的研究相比，本研究样本量较大，具有较好的统计学功效[11,15]。本研究探讨了以胎盘组织PAHs作为内暴露标志物与唇腭裂之间的关系，使用内暴露剂量作为评价指标，避免了单纯问卷调查可能存在的回忆偏倚和报告偏倚。实验中使用标准样品、空白对照、平行样品测定、病例与对照均匀检测等方法进行质量控制，同时在浓度计算过程中隐去研究对象的分组，避免了研究人员可能的暴露怀疑偏倚。

研究的局限性包括：(1)由于PAHs能够部分通过胎盘屏障进入胎儿，且胎盘对不同物质的阻隔作用不同，胎盘组织中不同种类PAHs的浓度可能与胎儿体内的分布情况存在一定差异。(2)病例组与对照组母亲职业存在明显差异，对照组母亲职业为农民的比例较大，但社会阶层或职业与污染物的暴露存在关联[16]，可能会使胎盘组织PAHs水平较高。病例与对照组母亲职业的差异也可能存在类似健康工人效应的选择偏倚，即母亲职业为农民，可能暴露于高水平的PAHs中，但由于个体敏感性差异其胎儿出生缺陷率可能更低。(3)由于样本获取的限制，病例组胎盘组织多在胎儿引产时收集，而对照组多为足月产胎儿的胎盘组织，因此病例组孕周显著小于对照组。理论上对照组胎盘组织具有更长的蓄积时间，可能是导致对照组胎盘组织PAHs浓度较高的另一个原因。

总之，本研究采用胎盘组织内PAHs作为暴露标志，未发现孕期PAHs暴露与唇腭裂风险存在关联性。今后可考虑采集唇腭裂诊断时的母亲尿液，检测PAHs的代谢产物，进一步研究孕期PAHs暴露与唇腭裂风险之间的关联性。