猪场疫苗免疫效果监测评估

张爱琼 ，曾智勇，梁海英，王 彬，咸 文，何小莉，陈 娟，吴好叶，黄二素

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

1 死亡率和日增重

死亡率和日增重是猪场疫苗免疫效果检验中重要的指标，是指在疫苗免疫后的相同时间间隔内对免疫猪只的死亡率和日增重进行统计分析，是免疫后对疫苗效果检验的重要手段之一。李军[1]设计7组试验，每组22头体重差异不大的仔猪，1～5组为试验免疫组，剩余6～7组为空白对照组，在首次免疫后随着日龄的增加，组间差异增大，试验免疫组较空白对照组日增重差异显着，疫苗免疫对猪只的保护最终优化了料重比。

2 PCR检测法

PCR检测方法是一种DNA体外扩增法，在实验室检测中具有快速、灵敏、准确的特点，可以对病毒DNA进行特异性扩增，以检测猪只感染所产生的病毒血症。李长海等[2]使用PCV2亚单位疫苗和PCV2全病毒灭活疫苗将1 000头仔猪分3组进行疫苗免疫效果研究，并在首免前和免疫后30 d、60 d、90 d采血分离血清，使用核酸提取试剂盒提取血样核酸，采用TaqMan荧光定量PCR检测方法对血样中PCV2病毒含量进行检测。结果显示，PCV2亚单位疫苗免疫组仔猪血样中PCV2病毒含量最少，免疫PCV2全病毒疫苗组病毒含量次之，对照组中PCV2病毒含量最多。PCR检测方法灵敏度高，可对病原进行快速特异性检测，疫苗免疫后对病毒血症及时检测也至关重要。

3 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测

抗体检测是最常规也是检验疫苗免疫效果的最经典方法，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法是抗体检测中最快速有效的方法，是将特异性抗原进行包被后测定疫苗免疫后血清中的抗体效价，该方法操作方便，能够快速进行抗体检测。Gu Z等[3]为研究PRV疫苗的免疫效果，使用15头4周龄仔猪（不含 PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV），每组5头仔猪，随机分成3组，第1组用PRV Bartha-K61疫苗接种，第2组用灭活的PRV vZJ01ΔgE/ gI疫苗接种，第3组为对照组，用PBS接种。在接种14 d后用相同的方法进行加强免疫接种，并在接种7 d、14 d、21 d、28 d、35 d收集血样，用ELISA和血清病毒中和试验（NT）对PRV的抗体进行测定。结果显示，在免疫后4～5周，灭活的PRV vZJ01ΔgE/ gI疫苗免疫猪比用Bartha-K61疫苗接种的猪产生显著更高的特异性免疫应答（P＜0.05），

但抗体水平显示PRV vZJ01ΔgE/ gI疫苗组和Bartha-K61组相似。李英等[4]对山东日照市8个养猪采集240份样品通过ELISA检测试剂盒进行PRV抗体检测，结果显示240份样品中有195份免疫合格，合格率达到81.25%，达到国家规定的抗体水平。ELISA检测方法，操作过程简单，不需要复杂的试验设备和条件，可用于猪场抗体的快速检测。

4 中和抗体检测

血清中和测定法可评估血清样品的中和能力，检测血清中的抗体效价。Zhang H等[5]选用16头5周龄杂交断奶仔猪（CSFV呈血清阴性）对IFN-γ作为免疫佐剂的CSFV E2亚单位疫苗保护性进行研究。实验分成4组，每组4头仔猪，A组猪（阴性对照组）肌内 注 射2 mL PBS，B组（ 阳 性对照组）的猪肌内注射单剂量的商业C-株疫苗，C组和D组的猪分别肌内注射2 mL E2和E2-IFN-γ亚单位疫苗，进行中和实验测定。所谓中和测定，即将血清样品在56 ℃下热灭活30 min，连续稀释2倍，然后在100 ℃下与100 TCID50CSFV Shimen菌株混合60 min。将血清-病毒混合物加入在96孔板中培养的汇合PK-15细胞中，然后在37 ℃下孵育3 d，用PBS洗涤PK-15细胞3次，并用冷的80%丙酮固定30 min，然后将固定的细胞与E2 MAb（1∶100稀释）一起，在37 ℃下温育 1 h。然后用PBS洗涤3次，将细胞与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗小鼠IgG在37 ℃温育1 h，然后用PBS洗涤3次，在荧光显微镜下观察。结果显示，C-菌株、E2和E2＋IFN-γ基团诱导CSFV产生的中和效价更高，但在初次免疫后28 d，这3组之间没有观察到显著差异（P＞0.05），中和滴度在14 d达到峰值，C-菌株组的平均中和抗体滴度为1∶304，E2亚单位疫苗组为1∶362，E2＋IFN-γ亚单位疫苗组为1∶608。在整个实验中在E2和E2＋IFN-γ组之间没有观察到中和抗体滴度的显著差异。

5 酶联免疫斑点检测

酶联免疫斑点检测是用抗体对细胞分泌的细胞因子进行捕获，并以酶联免疫斑点的形式显现出来。Oh T等[6]对4种韩国PRRSV商品化疫苗（Porcilis PRRS、UNISTRAIN PRRS、Ingelvac PRRS MLV、Fostera PRRS）免疫效果进行研究。其选用28日龄的200头仔猪，每40头猪分为1组、共分5组，分别为Vac1A组免疫Porcilis PRRS、Vac1B组免疫UNISTRAIN PRRS、Vac2A 组 免疫ngelvac PRRS MLV、Vac2B组免疫Fostera PRRS和对照组注射等体积的PBS，并采用酶联免疫斑点免疫效果评估，即在外周血单核细胞（PBMC）中测定用从农场分离的野外病毒刺激的PRRSV特异性干扰素 -γ分泌细胞（IFN-γ-SC）的数量。将接种于（5×105个PBMC /孔）的PBMC用MARC-145细胞裂解物（感染复数等于0.01）作为回忆抗原刺激20 h，在37 ℃，5 % CO2的条件下孵育。 使用自动酶联免疫斑点（ELIPOT）测定ELISPOT读数器对膜上的IFN-γ阳性斑点进行成像，分析和计数。结果显示，与未接种组相比所有4个接种组的仔猪在PBMC中具有显著（P＜0.05）更高数量的PRRSV-1和PRRSV-2特 异 性 IFN-γ-SC（ UnVac） 在21 d、56 d和84 d。 在56 d和 84 d时，Vac1A和Vac1B组与Vac2A和Vac2B相比猪在PBMC中具有显著更 高（P＜ 0.05） 的 PRRSV-1特异性IFN-γ-SC 数量。在21 d、56 d和84 d时，Vac2A和Vac2B组 与Vac1A和Vac1B组相比猪在PBMC中具有显著更高（P＜0.05）的PRRSV-2特异性IFN-γ-SC数量。最后，在84 d时Vac2B组与Vac2A组相比，猪在PBMC中具有显著更高（P＜0.05）的PRRSV-2特异性IFN-γ-SC数量。该方法灵敏度较高，比传统的ELISA方法灵敏度高很多，操作方面可进行高通量检测。

6 攻毒试验

攻毒保护试验是评价疫苗免疫效果最直接的方法，抽取一定数量的免疫猪只，用于疫苗对应的强毒病原微生物进行人工感染，检测疫苗的免疫保护效果。陈果亮[7]选取34日龄断奶仔猪50头，随机分5组，每组10头，A、B、C、D组接种不同厂家猪瘟疫苗免疫，E组作为空白对照组。在A、B组疫苗免疫后第7天后进行攻毒，肌注（1 mL）1×104TCID50石门猪瘟强毒，同时对疫苗空白对照E组进行同等剂量攻毒。攻毒后每天对猪只温度和临床变化进行测定，试验猪只在攻毒后14 d进行全部剖检，进行组织病理性和病毒核酸检测。结果显示，免疫猪瘟疫苗组在进行攻毒后没有出现明显的临床变化，猪只体温正常，疫苗免疫空白对照组在攻毒后2 d，猪只出现高热稽留，其中1头急性发病于攻毒后第9天死亡，其他猪只食欲下降、精神沉郁，皮肤出现猪瘟出血点或出血斑症状，攻毒后14 d对照组猪只全部死亡，对免疫组和对照组进行剖检观察，对照组出现典型的猪瘟病理变化，而免疫组脏器未见变化。其研究结果表明，猪瘟疫苗的疫苗免疫效果明显，保护率高。

7 总结

近年来，许多病原严重影响养猪业的发展，如我国新出现的非洲猪瘟就给养猪业带来了巨大的经济损失。疫苗免疫接种是防控传染病的重要手段[8]，规模化的养猪场更要做好猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等疫苗免疫工作，定时进行监测，加强饲养管理做好卫生清洁工作，坚持预防为主的养殖模式。建立疫苗免疫检测体系，避免因疫苗失效、疫苗剂量不足、药物刺激、功能性疾病、免疫方法等不当导致的免疫失败[9]，使我国养猪业健康、稳定的发展。