调节性T细胞参与ANCA相关血管炎的发病机制

刘春丽 商 玮 蔡 辉

(东部战区总医院，南京210002)

抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎(Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated vascul-itides，AAV)主要是以中小血管系统性炎症为主要特征的疾病。根据临床和组织病理学特征主要分为以下三类:①肉芽肿性多血管炎(Granulomatosis with polyangiitis，GPA)，②显微镜下多血管炎，③嗜酸性粒细胞肉芽肿性多血管炎[1]。免疫调节细胞的功能缺陷，抑制自身免疫反应的失败，打破自身耐受是AAV发病的主要原因[2]。调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)是维持外周免疫耐受必需的重要细胞，是阻止自身免疫的关键T细胞亚群，参与AAV的免疫调节功能已经得到逐步证实[3]，本文就AAV发病中T细胞可能的参与机制进行综述。

1 AAV中T细胞的持续活化

尽管在AAV的效应阶段抗中性粒细胞胞浆抗体(Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody，ANCA)发挥中心性作用，然而并不能排除T细胞的致病作用。疾病早期反复暴露于同一种抗原以及Tregs的功能障碍，均能导致AAV中T细胞的持续激活。在AAV受损的器官中均可检测到活化的T细胞，持续活化的T细胞数量与疾病的严重程度呈正相关[4]。

在GPA中，CD4+T辅助(T helper，Th)细胞的免疫病理学作用取决于疾病是局限性还是系统性。早期针对GPA患者的研究主要集中在Th1和Th2细胞之间的平衡关系。活动期的GPA患者CD4+T细胞主要表达Th1细胞相关标志物，进一步发现局部病变的患者外周循环和鼻肉芽肿组织中Th1相关标志物占主导地位，而系统性病变患者中Th2相关标志物则更为突出。最近证实在GPA患者中抗原特异性Th17细胞扩增，与疾病活动性和是否维持药物治疗无关[5]。活动性GPA患者中血清白介素-17(Interleukin-17，IL-17)水平升高，当进入缓解期时仍然维持在较高水平。利用蛋白酶3(Proteinase 3，PR3)体外刺激GPA患者的外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)能够导致IL-17和Th17细胞的转录因子RORγt表达增加，表明Th17细胞很可能参与AAV的免疫发病[6]。

2 AAV中启动和维持T细胞活化的机制

AAV中T细胞活化的启动和维持机制尚不清楚，有研究表明Tregs免疫抑制功能失常，免疫调节的打乱可能是维持AAV中T细胞持续活化的重要因素。

2.1 Tregs分子表型 40多年前首次发现T细胞具有免疫抑制能力，直到1995年才发现一类表达IL-2受体α链(CD25)的CD4+Th细胞亚群是阻止自身免疫反应的关键。敲除野生型小鼠的CD4+CD25+T细胞并将剩下的T细胞转染同源无胸腺小鼠体内能够诱导发生自身免疫和多器官损伤，当将CD4+CD25+T细胞回输后能够阻止自身免疫的发生[7]。随后在人体内也发现相似的CD4+抑制性T细胞或Tregs。共同培养CD4+CD25hiT细胞和CD4+CD25-反应性T细胞，发现CD4+CD25hiT细胞能够直接抑制CD4+CD25-反应性T细胞的增生和细胞因子形成。这些结果均表明Tregs表型CD4+CD25+的存在[8]。随后发现在Tregs表达的关键标记物转录因子FoxP3能将其与其他CD4+T细胞区分开来。首先在scurfy小鼠品系中检测到FoxP3编码scurfin蛋白，FoxP3基因的X连锁隐性突变导致16～25 d龄的半合子雄性小鼠死亡，淋巴细胞显示过度增殖，多个器官中CD4+T细胞浸润并产生大量细胞因子[9]。X连锁综合征(即IPEX)患者也存在FoxP3的突变，主要以免疫调节失衡、内分泌失调和肠道疾病为主要特征。此外一些研究显示scurfy小鼠和IPEX患者不存在CD4+CD25+Tregs。利用逆转录病毒将FoxP3转染至幼稚CD25-CD4+T细胞中能够诱导T细胞的产生，其在表型上和功能上类似于Tregs。以上结果表明FoxP3对于Treg的成熟和功能的发挥是必需的。根据幼稚和记忆CD4+Th细胞中FoxP3的表达水平不同，人外周血FoxP3+CD4+T细胞分为CD45RA+FoxP3lo静息Tregs(CD45RA+FoxP3loresting Tregs，rTregs)，CD45RA-FoxP3hi活化Tregs(CD45RA-FoxP3hiactivated Tregs，aTregs)和分泌IFNγ-和IL-2的CD45RA-FoxP3loCD25+Tregs三种类型。前两者(即rTregs和aTregs)在体外就能够发挥有效的抑制功能，而CD45RA-FoxP3loCD25+Tregs却不能。这表明仅凭FoxP3不能定义真正的抑制性Tregs。已有研究发现人Tregs存在几种不同的FoxP3亚型。第一种亚型是全长型FoxP3(Full-length FoxP3，FoxP3fl)，第二种亚型缺少外显子2型(Lacking exon 2，FoxP3Δ2)。不同的FoxP3亚型影响Tregs功能和分类。FoxP3fl与RORγt(Th17细胞的转录因子)相互作用并抑制Th17细胞基因的表达，而FoxP3Δ2型却不能。Tregs和Th17细胞的发育相互影响[10]。在体外中性条件下，β型转化生长因子(Transforming growth factor β，TGFβ)将平衡倾向功能性FoxP3+Tregs方向发展，而在炎性细胞因子IL-1β、IL-2、IL-15等存在下，功能性Tregs向产生IL-17的非功能性Tregs转化。因此，FoxP3结合CD25、CD45RA的表达对定义真正抑制性Tregs至关重要。

2.2 Tregs和作用机制 Tregs调节免疫的确切机制尚不清楚，可能通过分泌抗炎细胞因子、细胞溶解、代谢紊乱和调节树突状细胞(Dendritic cell，DC)的成熟和功能的发挥等不同机制作用的。Tregs能够产生大量细胞炎性因子如IL-10、IL-35和转化生长因子(Transforming growth factor β，TGF-β)抑制免疫细胞活化；Tregs释放酶(颗粒酶A或B)通过促进细胞溶解是诱导效应细胞凋亡的另一种机制；代谢紊乱，如当IL-2缺乏时诱导效应细胞死亡，Tregs还能够通过缝隙连接将可溶性介质环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)转移到靶细胞效应T细胞和DC中来抑制效应细胞功能发挥。在靶细胞中，cAMP诱导抑制细胞增殖和IL-2产生的诱导型cAMP早期阻遏物(Inducible cAMP early repressor，ICER)形成。最后，Tregs通过抑制性表面分子淋巴细胞活化基因(Lymphocyte activation gene，LAG)3和毒性T淋巴细胞相关抗原(Cytotoxic T lymphocyte-associated Ag，CTLA)-4调节DC成熟。当DC感知到这些分子的存在时，开始产生吲哚胺2，3-双加氧酶反过来抑制其他免疫细胞[11]。Tregs引发抑制的机制取决于抗原的剂量。高剂量抗原通过诱导Fas介导的细胞凋亡或T细胞受体(T cell receptor，TCR)连接引发有效抑制效应，这两者都导致T细胞无反应性，而低剂量抗原仅诱导IL-10或TGF-β的分泌[12]。Tregs可以通过抑制协同刺激因子作用和分泌抗炎细胞因子来抑制效应T细胞的活化以预防自身免疫[13]。在移植物抗宿主病中的研究发现，扩增的Treg对单核细胞的作用导致促炎细胞因子IL-6、TNF-α的产生和NF-κB活化的减少。此外，单核细胞与扩增的Tregs共同培养后共刺激因子和MHCⅡ类分子的表达下调，M2巨噬细胞特异性标志物、CD206、血红素加氧酶-1、IL-10的产生增加。与扩增的Treg共培养的单核细胞能够使产生IL-17的T细胞能力降低，这种促炎性Th17扩增能力的减少是共刺激分子CD86低表达所导致的。因此，扩增的Treg具有诱导单核细胞表型和功能变化的能力，这可能对移植中的耐受诱导、移植物抗宿主病和自身免疫疾病的预防和治疗至关重要[14]。总之，Tregs采用多种机制发挥其免疫抑制作用，并在抑制自身免疫反应中发挥关键作用。

2.3 AAV中的Tregs 在AAV中，Tregs免疫抑制功能的缺陷导致免疫细胞持续活化和慢性自身免疫炎症的发展。关于AAV免疫调节的研究多集中在Tregs的异常功能和/或比例改变上。尽管大多数研究都认为在AAV中Tregs的免疫抑制作用受损，主要是由数值或功能变化引起还是两者共同作用尚存在争议。

2.3.1 AAV中Tregs的比率和功能改变 关于AAV中Tregs的比率存在一些争议，通过比较缓解期GPA患者与健康人群或其他患者，GPA患者外周血中CD25hiFoxP3+Tregs的比例水平明显增加，但也有报道指出比率下降。CD4+CD25hiTreg的降低与患者接受的常规免疫抑制治疗相关，B细胞清除治疗患者的外周循环中Tregs数目与健康者相似，而与常规治疗的患者相比显著增加，而CD4+CD25hiT细胞区域的FoxP3表达未进行评估，尽管通过它能识别出活化的Tregs。另一项研究发现在疾病缓解期(≥1年)Tregs的比率显著增加，与免疫抑制治疗无关。Tregs的比率伴随着Th2比率的增加而增加，活动性AAV中Tregs数量的减少使得Th17细胞在缓解期扩增，而免疫抑制药物抑制Th17细胞并允许Tregs扩增导致Th细胞失衡[15]。综合上述实验结果表明免疫抑制药物可恢复缓解期AAV患者的Tregs比例。虽然目前对AAV的Treg比率没有达成共识，但大部分研究都报道了大多数AAV患者中Tregs的抑制功能出现降低。GPA患者中FoxP3+Tregs的比重增加了，通过其与AAV患者Tregs共培养后反应性T细胞增殖能力增加进而证明其抑制功能减弱。总之，这些结果表明尽管对AAV患者Tregs比重存在争议，但大多数研究都承认Treg功能减弱的事实。

2.3.2 AAV中Tregs功能障碍的潜在原因 尽管大多数研究显示AAV患者中Tregs的抑制功能减弱，可能的相关机制包括IL-6介导Tregs与Th17的转换、降低IL-2的反应性和增加FoxP3剪切变体的表达以及FoxP3启动子甲基化。炎症微环境可能诱导Tregs免疫抑制活动降低，如在糖尿病患者中Tregs能转变为Th1细胞。Th1样Tregs除FoxP3外还表达Tbet和CXCR3，并分泌IFNγ，表明这些Tregs已失去其免疫抑制功能[16]。当用同种异体抗原呈递细胞，尤其是单核细胞刺激时，CD25hiFoxP3+T细胞可以转化为产生IL-17的T细胞，外源性IL-1β、IL-23和IL-21能够增强这种转化，而IL-6或TGF-β却不能[17]。类风湿关节炎(RA)和癌症患者炎症部位FoxP3的Th17样Tregs表达更丰富。而在AAV中，炎症部位Tregs也似乎更倾向于产生IL-17，这些可能是由于炎症微环境中IL-6和TGF-β的产生增加造成的。炎症部位Tregs免疫抑制能力的下降可能与暴露于IL-6和TGF-β有关。AAV患者Th17水平升高和Treg功能减弱，表明这种机制可能也参与AAV的发病。IL-6似乎发挥更重要的作用，当暴露于IL-6时，Tregs失去其抑制功能，同时支持Tregs的抑制功能的转录因子Helios表达水平也降低。单克隆抗体Tocilizumab阻断IL-6受体的RA患者，与未阻断治疗者、健康对照者相比，Helios+FoxP3+CD4+T细胞的比例增加[18]。在AAV中，炎症局部高水平IL-6促进Tregs向产生IL-17的T细胞转化，抑制功能丧失，进而导致持续的效应细胞活化。AAV中Tregs的抑制能力下降可能与IL-2的反应性降低有关。与健康对照者相比，AAV患者中活化的Th细胞和Tregs上IL-2受体(IL-2R，CD122)β链表达显著降低[19]。IL-2是一种细胞因子，Tregs在稳态和炎症条件下功能的发挥都需要它。当Tregs对IL-2的反应能力下降时可能不会发挥其抑制功能[20]。

FoxP3亚型的异常表达可能是AAV中Tregs功能异常的原因。FoxP3fl与RORγt相互作用并抑制Th17细胞基因的表达，而FoxP3Δ2却不能。因此，FoxP3Δ2可能导致Tregs中RORγt的显性表达，从而导致IL-17的产生，并将Tregs向致病性Th17细胞转化。与健康对照者相比，活性和非活性AAV患者中Th细胞中的FoxP3Δ2型均增加，FoxP3fl比例却降低。AAV患者Tregs抑制能力的下降程度与缺乏外显子2型Tregs的比例呈正相关[21]。总之，FoxP3的剪接变体的表达可能是抑制功能降低的原因。

Tregs的表观遗传学异常也是AAV中Tregs抑制活性下降的原因。FoxP3启动子中的CpG基序，也称为Treg特异性去甲基化域(Treg-specific demethylated region，TSDR)，去甲基化后才能导致FoxP3基因转录[22]。在静息态的常规T细胞中，该基序仅轻微发生去甲基化。乙酰化组蛋白与Tregs中的FoxP3启动子较常规T细胞关联性更强，这可能使得FoxP3启动子更容易接近RNA聚合酶，Tregs中FoxP3特异性转录，激活Tregs抑制功能。失活的Tregs不表达FoxP3，抑制活性下降，这些均与去甲基化TSDR相关[23]。AAV中的组蛋白乙酰化程度是否较低，以及是否增加FoxP3启动子的甲基化并导致更多的无活性Treg产生需要进一步研究。尽管上述这些可能与AAV中Tregs的抑制能力降低有关。然而，其在AAV中受损的确切机制仍有待进一步研究。

总之，AAV免疫调节细胞亚群的数值和功能改变，自身反应性T细胞的清除和充分抑制的失败，导致针对自身蛋白免疫应答的启动和蔓延，自身反应性效应T细胞的不断增殖和致病性自身抗体产生。尽管存在研究之间的差异，但在大多数研究中发现Tregs的抑制功能减弱。T细胞中效应细胞和调节细胞之间的失衡是AAV发病机制的一个重要方面，这表明当构建恢复这种平衡时对AAV患者有显著的益处。