棉花细胞质雄性不育的研究与利用

王学德



棉花细胞质雄性不育的研究与利用

王学德

（浙江大学农业与生物技术学院，杭州 310058）

棉花具有十分明显的杂种优势。杂交棉通常比常规棉增产15%左右，而且在纤维品质、抗病、抗虫、抗逆境和光合效率等性状上也有明显改良。在棉花杂种优势的利用中，最重要的环节之一是杂交种子的生产（制种）。目前，杂交棉制种常有四条途径，人工去雄授粉法制种、化学杀雄法制种、利用核雄性不育的“两系法”制种和利用细胞质雄性不育的“三系法”制种。生产实践表明，利用棉花雄性不育既可简化制种又可节省成本，特别是利用棉花细胞质雄性不育系、保持系和恢复系的“三系法”制种，可较有效克服其他制种方法的一些缺点，是最有效的途径。为此，文章在阐述棉花杂种优势利用途径的基础上，重点综述棉花细胞质雄性不育的遗传学、细胞学和生理生化的特点；深入阐述不育细胞质对杂种F1的正/负效应，并就如何培育强恢复系的问题，以培育转的强恢复系为例，探讨克服不育细胞质对杂种F1负效应的可能机制；根据棉花为常异花授粉作物和花器具有虫媒花特征的特点，详细介绍三系杂交棉制种的亲本（不育系和恢复系）选配、地点选择和环境优化等条件，以及如何综合优化这些条件提高制种产量的关键技术。利用棉花细胞质雄性不育的“三系法”制种，与其他作物比较，在杂种优势利用中具有4个突出的优点：（1）不育系为无花粉不育类型，育性不受气候等环境的影响，可保证杂种的纯度；（2）棉花开花期长达3个月，不存在制种时花期不遇的现象，制种产量有保证；（3）棉花生态适应性广，育成的组合可在各地种植，种子产业化效益明显；（4）可利用种间（海岛棉与陆地棉间）杂种优势。可以预言，基于细胞质雄性不育的三系杂交棉是大有前途的，将是棉花杂种优势利用的主要途径。最后，就本领域的发展趋势，特别是在利用现代生物技术培育新的不育系和恢复系方面进行了初步探讨。

棉花；细胞质雄性不育；杂种优势

棉花具有十分明显的杂种优势，杂交棉通常比亲本（纯合品种，也称常规棉）增产15%左右，同时也可综合亲本的优质和抗病虫等性状。随着棉花精细播种、育苗移栽、地膜覆盖和点播稀植等技术的推广，以及制种技术的不断改良，使棉花杂种优势能够在生产上大面积应用。近年来，中国杂交棉种植面积已达棉田总面积的15%—30%。

1 棉花杂种优势的利用途径

棉花杂种优势的利用最重要的环节是杂交种子的生产，即人为控制棉花异交，使2个不同亲本的性状互补而产生具有杂种优势种子的过程。为实现杂交，一般将一亲本中的雄蕊去掉（或使它不能产生有活力的花粉粒），留下正常的雌蕊，即：人为地将其两性花转变为单性花。采用的方法常有3种：人工去雄法、化学杀雄法和雄性不育的利用。去雄后的花朵，只有授予花粉才能结种（杂交种子）。采用的授粉方式为人工授粉或自然昆虫授粉，或2种授粉方式相结合。

棉花是常异花授粉作物，其花朵的结构具有虫媒花的特征（花冠大而鲜艳，花器官中具有蜜腺，以及花粉粒表面具有棘突等等），在通常环境条件下，有3%—20%的异花授粉率。如果棉田有丰富的传粉昆虫（如养蜂），这种异花授粉率将会大幅度提高，为基于雄性不育的杂交种子生产提供了较高的天然异交率，从而省去授粉环节。但由于棉花是常异花授粉作物，不育系的繁殖和杂交种的制种均需要建立隔离区，以防止其他棉花品种的花粉传入繁种田或制种田。隔离区距离要根据地形、蜜源植物及传粉昆虫的多少等因素来确定，一般距离0.5—1 km。隔离区内不种其他棉花。

1.1 人工去雄授粉法制种

棉花人工去雄授粉法制种，是指用人工除去母本花朵中的雄蕊，然后授以父本花粉，获得杂交种子的过程。棉花花器较大，用人工去雄较容易。通常，将开花前一天的母本花蕾剥除雄蕊，次日上午取父本花粉授于已去雄的母本柱头上，当棉花种子成熟时，按组合收获其杂交种子，从而实现人工去雄授粉法制种的全过程。

在人工去雄授粉制种田里，母本与父本常按适当行比例间隔种植，如：母本每种4—6行，父本种1—2行，即4—6﹕1—2间隔种植。制种时，每天下午对母本行进行人工去雄，每天上午取旁边的父本花粉给前一天去雄的母本授粉，操作方便。在棉花开花的整个时期（约70 d），需每天去雄和授粉，以产生足够量的杂交种子。据估计，每人每天可生产0.5 kg杂交种子。在生产上，为节省杂交种子的用种量，常采用点播、营养钵育苗移栽和适当稀植等技术，0.5 kg的杂交种子常可供667 m2棉田的播种。

人工去雄授粉法制种，优点是杂交组合选配容易，育种周期短，应变能力强；缺点是费工和成本高，适用于劳动力价格较低的地区。

1.2 化学杀雄法制种

选用适当的化学药剂，配成适当浓度的水溶液，在棉花开花初期，喷洒在棉花植株上，由于雄配子比雌配子对药剂更敏感，雄配子被杀死造成雄性不育，而雌配子不受影响仍正常可育，这种致使雄性不育的化学药剂称为“化学杀雄剂”。经化学处理后的雄性不育棉花作母本，授以父本正常可育花粉，就可获得杂交种子。用化学杀雄法制种，省去了人工去雄的环节，可大大降低制种成本。

在棉花上，曾使用过的化学杀雄剂主要有：二氯丙烯、二氯酸钠（又称茅草枯）、二氯异丁酸、二氯乙酸、顺丁烯二酸、青鲜素（简称MH30）、二氯异丁酸钠（又称232或FW-450）等。这些化学药剂均有不同程度杀死雄配子的效果，表现为花药干瘪、花粉粒无生活力。一般在现蕾初期和开花初期的棉株上，各喷一次配制好的杀雄剂水溶液，便可达到杀死雄配子的效果。之后开放的花朵，因雄蕊不育，不需去雄，只需授以父本花粉即可。但上述药剂均存在某些不足，主要问题：一是杀雄效果不够稳定。因棉花现蕾和开花时期长，药剂使用时间和药效持续时间较难掌握，难以使棉花的所有花朵均雄性不育；二是准确的药剂用量较难掌握。浓度不当，往往引起药害或杀雄不完全；三是化学药剂可能存在环境污染的风险。化学杀雄法生产棉花杂交种因缺乏有效的杀雄剂和需要多次喷施杀雄剂（棉花花期时间长）致使棉花整株不育，至今没有在生产上有效使用。一旦找到有效的化学杀雄剂，化学杀雄法制种将是一种经济的制种方法。

1.3 利用雄性不育的“两系法”和“三系法”制种

1.3.1 利用核雄性不育的“两系法”制种 两系法是指利用棉花细胞核雄性不育的制种方法。这种棉花雄性不育是受核基因控制，如，中国洞A不育系的雄性不育是受1对核隐性基因msms控制，可被含MSMS的恢复系恢复育性，这种核不育系与相应恢复系杂交而生产杂交种子的方法，称为“两系法”制种。在生产上核不育系与恢复系间隔种植，可依赖于传粉媒介（如：蜜蜂）自然传粉，也可人工辅助授粉，或者自然传粉与人工授粉结合，从不育系上获得杂交种子。但核雄性不育的保持（即，不育系的繁殖），较麻烦，这由其遗传特性所决定。如以洞A不育系为母本（msms），与恢复系（MSMS）杂交，所得杂种F1的基因型为MSms，自交产生的F2群体会有育性分离，即可育的MSMS和MSms植株，以及不育的msms植株，其分离比例为1﹕2﹕1。不育系的繁殖就是利用MSms植株的花粉，与msms不育株杂交，让其后代分离出一半的可育株（MSms）和一半的不育株（msms），每年如此操作来繁殖不育系种子。不难看出，其中的不育系种子（约占50%），一方面供杂交棉制种所需，另一方面供不育系繁殖所需，起到“一系两用”的作用。

从不育系繁殖田中得到的种子，在基因型上有MSms和msms 2种类型，制种时它们被播种在制种田的不育系行中，旁边播种恢复系（MSMS）行。临近开花时，不育系行中，需要剥蕾鉴别出可育与不育株，以便拔去50%的MSms植株，保留另外50%的msms植株用于制种。经上述操作去掉可育株后的制种田中，只有msms和MSMS 2种基因型，即：不育系和恢复系棉株，这样不育系只能从恢复系中得到花粉，制成的杂交棉种子的纯度是高的，否则，因去除可育株不彻底，杂交种子中会混杂不育种子，影响杂交棉的产量。

两系法制种的优点是恢复系来源广泛，有利于选配强优组合，更换组合也相对容易。但也存在不足，如：在制种时，需要鉴别可育株和不育株，以拔除50%左右的可育株，造成人工、肥料、农药等的浪费，且降低了制种母本的种植密度。

1.3.2 利用细胞质雄性不育的“三系法”制种 三系，即不育系、保持系和恢复系，是利用棉花细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）进行杂交种子生产（制种）的体系。棉花细胞质雄性不育，与1.3.1所述的核雄性不育不同，除了受核基因控制外，还受细胞质基因控制，是质核互作的不育，其育性既可被保持系保持（不育系的繁殖），也可被恢复系恢复（杂种F1的制种）。通常，不育系、保持系和恢复系的基因型分别用S（rfrf）、N（rfrf）和S（RfRf）或N（RfRf）表示，其中，S和N分别表示不育和可育细胞质基因型，rf和Rf分别表示不育和可育的核基因型。在不育系的繁殖田中，不育系与保持系按比例（如4﹕1）间隔种植，通过自然传粉或人工授粉，不育系获得保持系的花粉而收获的种子即为不育系；而在制种田里，不育系与恢复系也按适当比例间隔种植，也通过自然传粉或人工授粉，不育系从恢复系获取花粉后所结的种子即为杂交种子。这种杂交种子的生产方式被称为“三系法”制种，制种获得的杂种常被称为“三系杂交棉”。与“两系法”比较，“三系法”制种的优点是不育系繁殖方便，克服了在制种时需要拔除50%左右可育株的缺陷。

棉花细胞质雄性不育的研究始于美国。20世纪60年代，具有异常棉（WaWara & Peyr）和亚洲棉（L.）细胞质的雄性不育类型分别被育成，但由于育性不稳定，没有实现三系配套。20世纪70年代，MEYER[1]育成和发放具有哈克尼西棉（Brand.）细胞质的雄性不育系，但由于恢复系存在恢复力不强和制种产量低等的缺陷，较难实现三系杂交棉种子的产业化。浙江大学王学德等[2]用转基因技术将一个延缓细胞衰老的谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase，GST）基因导入待改良的恢复系中，于2000年育成一个转基因强恢复系——浙大强恢，克服了恢复系对不育系恢复力不强的缺陷，现已广泛应用于三系杂交棉的育种研究。

在上述棉花杂种优势的利用途径中，人工去雄授粉制种将随着劳动力价格的提高逐渐被淘汰，化学杀雄法制种尚需研制杀雄剂，只有基于雄性不育的制种才是更可行的途径。为此，本文重点对棉花细胞质雄性不育的细胞学、遗传学和分子生物学的特点，以及三系杂交棉制种等技术问题进行阐述或讨论。

2 棉花细胞质雄性不育的特点

2.1 不育花器的特点

2.1.1 不育花器的形态特征 棉花细胞质雄性不育系的花朵均比保持系和恢复系的花朵小，其雄蕊的花丝短，花药小而干瘪，用手指捻碎花药，无花粉粒可见。从表型上很易辨别不育株和可育株。经观察[3]，与保持系和恢复系比较，不育系的花药体积分别小77.55%和77.73%，鲜重轻67.18%和63.34%，柱头长度短9.31%和26.7%，受精前胚珠体积小40.96%和52.77%。

2.1.2 不育花药的生化特征 经测定[3]，与可育花药比较，不育花药主要有如下特点：（1）淀粉含量极显著减少，淀粉酶同工酶缺失和酶活性降低。（2）脂肪含量明显偏低和酯酶同工酶缺失。（3）蛋白质含量低及其氨基酸组成异常，如脯氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸含量明显降低。（4）内源激素含量异常，表现为吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）和玉米素核苷（ZR）偏低，而脱落酸（ABA）偏高。（5）活性氧产生速率上升，H2O2和MDA含量增多，而超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶和细胞色素氧化酶活性降低。尤其值得关注的是上述不育花药的生化异常主要发生在小孢子母细胞减数分裂时期。

2.2 不育花药的细胞学特点

以保持系花药为对照，在显微镜下观察不育花药的细胞形态，可发现如下特点[4]。

2.2.1 小孢子母细胞减数分裂的异常 早在造孢细胞增生和增大期，不育花药中可普遍观察到比可育花药明显多的含2—3个微核的造胞细胞。其中，有些造孢细胞增大体积后形成的小孢子母细胞没有进入正常的减数分裂，而是以有丝分裂方式形成比正常小孢子母细胞明显小的细胞且逐渐坏死。即使有的造孢细胞能形成小孢子母细胞，但也不能进行正常的减数分裂，如在中期，当大多数染色体排列在赤道板时，尚有个别染色体落后散布于赤道板外面；又如在后期，染色体运动至两极后，染色体未集中于两极，而是凝结成若干个大小不一的团块散布于两极。

因此，棉花细胞质雄性不育，最明显的特点是发生早，早在小孢子母细胞形成及其减数分裂时期就出现异常，使不育花药内不能形成小孢子（花粉），致使棉花细胞质雄性不育很稳定，不受外界环境的影响。

2.2.2 绒毡层细胞的过早退化 不育花药在小孢子母细胞败育的同时，绒毡层细胞的退化也十分明显。在花药内形成造孢细胞以后，药壁有3层细胞，即表皮层细胞、过渡层细胞和绒毡层细胞，此时不育花药的绒毡层细胞在大小上与可育花药的绒毡层细胞无明显差异，但细胞已开始液泡化，染色较浅。随着小孢子母细胞增殖，过渡层细胞经一次平周分裂，药壁细胞已有4层，即表皮层、药室内壁、中层和绒毡层。这时，可育花药的绒毡层细胞不但大而染色深，常含有双核；相反，不育花药的绒毡层细胞趋向停止分裂和生长，不但体积很小（与中层细胞的大小相近），而且往往高度液泡化，在细胞形态学上与可育花药的绒毡层细胞形成十分明显的对比。在不育花药内，小孢子母细胞退化解体后，绒毡层细胞在功能上不再为小孢子起运输和同化营养物质等功能，而细胞径向分裂和膨大充塞整个花粉囊室，室中间只留下坏死的小孢子母细胞的痕迹，形成无花粉粒的不育花药。

因此，在棉花细胞质雄性不育花药内，小孢子母细胞的败育与绒毡层细胞的过早退化密切相关。

2.3 雄性不育的遗传特点

目前，棉花细胞质雄性不育最有利用价值的是具有哈克尼西棉细胞质的雄性不育，它是陆地棉的细胞核与哈克尼西棉的细胞质相互作用引起的雄性不育，也可以说是异源的质-核不亲和性而产生的雄性不育。由此可见，研究哈克尼西棉细胞质雄性不育的遗传特点，不但要研究细胞核中的育性基因，还要研究细胞质中的相关基因，以及这两类基因的相互作用。为此，王学德等[5-6]自1988年起，对该不育系的核基因和细胞质基因进行了分析。

2.3.1 核基因——恢复基因和育性增强基因的遗传特点 以8个棉花细胞质雄性不育系（A）和保持系（B），以及6个恢复系（R）为材料，通过杂交、自交、回交和测交，获得55种类型的研究群体；其中，NCⅡ交配获得的（A×R）F1及其F2各有27个组合，回交获得的（A×R）F1×B和A×（A×R）F1共有19个组合，等位性测验群体（At×R）F1×（Ack×R）F1有9个组合（At为待测不育系，Ack为对照不育系）。通过对各群体育性的遗传分析（孟德尔式），发现棉花细胞质雄性不育系育性恢复的遗传可概括为以下几个特点：

（1）不育系的育性恢复受2个独立的显性基因（Rf1和Rf2）控制，Rf1和Rf2称为恢复基因，其中，Rf1为完全显性，Rf2为部分显性，Rf1对育性恢复的遗传效应大于Rf2；Rf1和Rf2对不育系的育性恢复起主导作用，但育性恢复的程度可被一个称为育性增强基因（E）所促进；E与Rf1和Rf2无连锁，但存在互作。这一遗传模式，与前人对哈克尼西棉细胞质雄性不育的遗传研究有所不同。MEYER[1]报道育性恢复受2对独立遗传基因控制，其中一对是显性基因（F-），另一对是纯合隐性基因（ss）。WEAVER等[7]和SHEETZ等[8]则认为育性恢复是受1个部分显性基因（Rf）控制，但在育性分离世代中常出现比例偏离期望比例的现象，在个别杂交组合的分离世代群体中，还有2对基因控制的表型分离比例。显然，棉花细胞质雄性不育的遗传较复杂，使上述研究结果不甚一致。也有可能研究者在育性鉴定标准上存在差异；因为在育性分离世代中，有些棉株的花药虽有花粉但育性很低，与不育（无花粉）花药较难区分，这时有可能将那些弱育性可育株错归为不育株，使其研究结果不准确。

（2）由于恢复基因与育性增强基因的作用不同，在棉花细胞质雄性不育及其恢复的系统中，存在2个不同的概念，即恢复性和恢复度；恢复性是指不育系与恢复系杂交恢复基因抑制雄性不育的表达使F1表型呈可育的特性，而恢复度是指育性增强基因促进恢复基因的表达使F1育性显著提高的量。而育性增强基因往往存在于海岛棉中，因为陆地棉不育系与海岛棉恢复系杂交，或海岛棉不育系与陆地棉恢复系杂交，其杂种F1的花粉育性有明显提高[8-10]。

另外，观察还发现：

（1）不育系的保持系来源较广，陆地棉和海岛棉类型品种均可作不育系的保持系，这对于培育陆地棉和海岛棉类型不育系[10]以及配制海陆杂交种[9]提供了十分有利的条件。

（2）恢复系来源较窄，且存在恢复能力较弱的问题。大多数恢复系与不育系杂交产生的F1，由于有部分花粉生活力弱，当天气干旱和高温时，结铃率偏低和不孕籽率较高，影响杂交棉的产量和品质[10-11]。因此，选育强恢复系在三系杂交棉育种中尤为重要。

2.3.2 细胞质基因——线粒体基因的变异 王学德等[12]和蒋培东等[13]以哈克尼西棉细胞质雄性不育系和保持系花药为材料，分别提取线粒体DNA和蛋白质，进行DNA测序分析和蛋白质SDS-PAGE分析，发现不育系线粒体基因及其表达产物存在明显的变异，主要有以下2点：

（1）与保持系比较，不育系的线粒体基因——细胞色素氧化酶（cytochrome oxidase，COX）基因有5个碱基发生了突变，A184、C255、A366、C442和G516分别被替换为C、T、C、A和C，从而使不育系推导的氨基酸Ser62、Lys122、Thr148分别被Arg、Asn和Asn替代，而Ser85和Leu172因存在密码子简并现象未发生变化，不育系在上既发生了错义突变又发生了无义突变。这表明棉花细胞质雄性不育与线粒体基因的变异有关，巩养仓等[14]也有相似的推测。

（2）不育系线粒体中的31 kD蛋白质只有在花药中缺失，而在黄化苗中仍存在，这表明棉花细胞质雄性不育基因的表达具有严格的时空顺序。例如，反映在细胞形态学上不育系的败育时期是在造孢细胞增殖至小孢子母细胞减数分裂时期，败育的空间是在小孢子母细胞和绒毡层细胞。因此，研究植物雄性不育基因的表达选择合适的研究材料（如败育时期的花药）是重要的。

线粒体存在于真核生物的所有细胞中，提供细胞内生命活动所需的大部分能量，同时又是TCA循环、氧化磷酸化及脂肪氧化的细胞器。线粒体在遗传上有自主性，含有一套能自我复制、转录和翻译的基因组。但线粒体中的大部分蛋白质是由核基因编码的，只有约10%的蛋白质是由线粒体基因编码。因此，质-核关系的协调或亲和性对线粒体执行正常功能是必需的。棉花细胞质雄性不育是通过将四倍体陆地棉的核置换到二倍体哈克尼西棉的细胞质中引起质-核不亲和性而产生。在本研究中，对不育系线粒体DNA及其蛋白质的分析，所显示出的变异可能涉及线粒体功能的失调，这种失调也可能是哈克尼西棉细胞质与陆地棉细胞核间的不亲和性所致。当不育系与恢复系杂交，F1被引入恢复基因后，线粒体蛋白质恢复正常，说明恢复基因产物可弥补不育系线粒体的缺陷。

2.4 不育细胞质对杂种F1的效应

棉花不育细胞质对杂种一代的遗传效应是棉花细胞质雄性不育能否成功地应用于杂交棉生产的重要问题，一直受到棉花育种工作者的高度关注。为此，王学德等[15]组配3类杂种，即S（A×R）F1、S（R×B）F1和N（B×R）F1，进行3次重复的随机区组比较试验，记载了杂种的农艺性状和花药育性性状，以便在相同核背景和育性恢复的条件下比较不同细胞质（不育细胞质S和可育细胞质N）对F1的效应。

2.4.1 不育细胞质对杂种F1花药育性的效应 具有不育细胞质的杂种S（A×R）F1和S（R×B）F1，虽然花药育性趋向正常，但花药内花粉的可育程度仍不及可育细胞质杂种N（B×R）F1，不育细胞质（S）杂种的平均可育花粉率（85.12%）比可育细胞质（N）杂种（89.15%）低4.39%。尤其反映在自交结铃率上的差异更明显，不育细胞质杂种的自交结铃率比可育细胞质杂种低26.14%，而且不孕籽率上升10%左右。

观察还发现，不育细胞质对F1的效应明显反映在花药的形态性状和生化物质含量上。与可育细胞质杂种比较，不育细胞质杂种的平均每粒花药体积小0.90 mm3，每百粒花药干重轻3.1 mg，分别达极显著和显著差异；鲜花药内的可溶性蛋白质含量低4.06 mg·g-1，差异显著，但可溶性糖和淀粉含量在两类杂种间差异不明显。

2.4.2 不育细胞质对杂种F1产量和品质的效应 同样利用上述的3类组合，进行3次重复的随机区组比较试验，记载其产量和品质性状，结果表明，不育细胞质对F1产量性状具有明显负效应。其中，对皮棉产量的影响最大，与可育细胞质杂种相比，不育细胞质杂种平均产量下降84.06 kg·hm-2，差异显著（=0.05）；其次，是铃数和衣分分别下降0.66个/株和1.12%，而铃重在2种组合间差异不明显。不育细胞质对F1纤维品质效应不十分明显，而且2种组合间的差值有增也有减，无明显规律性变化，但从平均数上看，纤维长度有下降趋势，整齐度、比强度和马克隆值则有上升趋势。

赵存鹏等[16]研究表明冀2658A的不育细胞质对F1的效应主要表现为衣分显著降低（比对照组低1.61%）、黄萎病抗性增强（黄萎病指数比对照组低18.29%）和棉籽中的粗脂肪含量降低（比对照组低2.88%）。

3 外源GST克服不育细胞质的负效应

3.1 克服不育细胞质负效应的策略

不育细胞质对杂种有负效应，尤其在高温或低温胁迫条件下[11]，杂种花粉活力较低，从而引起三系杂交棉（F1）结铃率较低和不孕籽率较高。主要有2方面原因：其一是棉花细胞质雄性不育系败育时期过早（减数分裂时期败育）；其二是恢复系的恢复力不够强。从遗传角度分析，这一现象实际上是恢复基因不能彻底抑制不育基因所至。克服这一缺陷，虽然可从推迟不育系败育时期着手，但这不利于不育系的育性稳定性，因为败育时期早是育性稳定的有利条件，这一优点应保留。所以，最好从提高恢复系的恢复力着手，引入强恢复基因或育性增强基因。即，提高三系杂交棉花粉育性。从育种角度分析，就是要提高恢复系的恢复力，彻底抑制杂种中不育细胞质的效应。从细胞生物学角度分析，三系杂交棉花粉生活力低是雄性细胞发育不佳，过早衰老的表现。细胞衰老常伴随细胞氧化，细胞氧化常由过多活性氧积累所致。因此，三系杂交棉通过引入抗氧化基因，抑制雄性细胞活性氧积累，对于进一步改良其花粉育性具有重要意义。

3.2 GST的抗氧化功能

谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase，GST）是一种抗细胞氧化的酶，在提高细胞膜的修复能力和延缓细胞衰老具有重要功能，常被认为是一种抗逆性酶。在植物中，除草剂、病原微生物、重金属离子、盐胁迫、高温、冷害、机械损伤等都会诱导的表达。外源转化植物后常表现为GST的优势表达，能提高植株的抗逆境能力。VIGINA等[17-18]将一个具有GST酶活性的基因导入烟草后，发现转基因植株抗冷害和抗盐害的能力明显增强，进一步研究表明，外源是通过优势表达，提高转基因植株GST酶活性，从而保护其他抗氧化酶，进而提高转基因植株的活性氧清除能力，防止逆境条件下氧应激的产生和膜脂过氧化。YOUSUKE等[19]从烟草叶肉组织中克隆到一个受生长素（IAA）诱导的——。据研究属φ类（植物GST酶可分为φ、τ、θ和ζ四类），具有很强的抗氧化能力。BUNICHI等[20-21]将导入拟南芥，发现优势表达的转植株能显著提高由重金属和H2O2诱导氧应激的抵抗能力。

植物细胞质雄性不育常与线粒体基因的突变有关，而线粒体基因突变常引起线粒体膜受损和功能的失常，以及活性氧异常积累，乃至细胞衰亡。这种受损首先发生在雄性细胞中，因为它比其他细胞受环境的影响更敏感。由于三系杂交棉（F1）含有不育细胞质，如果核恢复基因的效应不够强，不能完全修复不育细胞质中的线粒体功能缺失，或不能完全消除活性氧毒害，就有可能影响花粉的育性，导致部分花粉生活力的降低，这是以往三系杂交棉存在的问题。为克服现有恢复系对不育系恢复力不够强的缺点，王学德等[2-3]用根癌农杆菌介导法，将一个具有抗逆性能的谷胱甘肽S转移酶基因（）导入恢复系，育成一个对不育系具有强恢复力的恢复系——浙大强恢，以提高三系杂交棉花粉育性。

3.3 GST促进杂种F1的花粉育性

3.3.1 外源对三系杂交棉（F1）花粉育性的促进作用 以受体恢复系0-613-2R和DES-HAF277为对照，浙大强恢分别与3个不育系HA277A、中12A和抗A杂交，用甲萘酚-联苯胺染色法测定8个组合的F1可育花粉率，统计杭州和三亚两地数据。数据显示，以浙大强恢为父本与不育系杂交，其F1的可育花粉率达92.12%，比以0-613-2R和DES-HAF277为父本的F1可育花粉率分别提高15.2%和25.80%，达显著和极显著水平。另外，从花器的表型也可明显看出，（抗A×浙大强恢）F1比对照（抗A×0-613-2R）F1和（抗A×DES-HAF277）F1的花器要大，且花药大，花粉多，散粉好。浙大强恢的恢复力比原2个受体恢复系有显著提高，表明对不育系的育性恢复有促进作用。

3.3.2 外源对三系杂交棉（F1）产量的促进作用 用浙大强恢配制的7个组合杂种种子，进行5个地点3次重复的比较试验，筛选出1个最好的三系杂交棉组合浙杂166。该组合在5个点的平均皮棉产量为1 173.0 kg·hm-2，比推广良种泗棉3号增产10.6%，其中，有1个地点的增产达21.2%。试验还表明，浙杂166单株结铃数比对照多3.6个，单铃重增加0.6 g，特别是不孕籽率显著降低10.1%。由于浙大强恢对不育系具有强的育性恢复力，用它配制的杂种F1（浙杂166）花粉育性得到极显著提高，从而有利于结籽率和结铃性的提高，也间接提高了单铃重。除了比强度较差外，纤维品质其他指标与对照无显著差异。

另外，由于浙大强恢花药散粉好，使它的制种产量也有明显提高。例如，在浙江的杭州、金华、兰溪、绍兴、宁波等制种田中，不育系与恢复系按2—4﹕1间隔种植，借助天然传粉媒介，配适当的治虫等田间管理措施，不育系花柱能得到较丰富的恢复系的花粉，从而获得较高的制种产量，与恢复系种子产量无显著差异。

3.3.3 外源对三系杂交棉（F1）的生理生化效应 为进一步检测外源引入三系杂交棉后的生理生化效应，朱云国[22]测定浙大强恢所配强育性F1和DES-HAF277所配弱育性F1等4个材料的根、茎、叶和花药的表达水平，以及所引起的一些生化指标。结果显示，外源在花药中比在其他器官中有优势表达的特点。浙大强恢所配F1花药的转录量比受体恢复系DES-HAF277所配F1花药高1.6倍，均达极显著差异。外源的导入，除了使杂种F1花粉育性提高外，还会引起其他生理生化性状的明显变化（一因多效）。表现为花药活性氧（O2.-和H2O2）产生速率的极显著降低，抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT、抗坏血酸过氧化物酶APX）活性、呼吸速率和抗氰呼吸等指标的明显提高。

3.3.4 外源克服不育细胞质负效应的可能机理 外源导入恢复系后，育成转恢复系——浙大强恢，通过与不育系杂交，引入外源于三系杂交棉（如浙大166）中，使优势表达，提高三系杂交棉花药的GST酶活性，促进活性氧的清除，防止逆境条件下氧应激的产生和膜脂过氧化，从而有效保护花粉的育性，克服由于花粉育性偏低而引起的结铃率低和不孕籽率高的负效应。根据这一现象，提出了棉花细胞质雄性不育与育性恢复的可能机理（活性氧假说）[2,13,22]。

4 三系杂交棉的制种

4.1 三系杂交棉的亲本——不育系和恢复系

三系杂交棉的育种关键是亲本选配，选择能产生强优势的2个亲本——不育系和恢复系，通过杂交获得比当地推广品种显著增产和优质的杂交组合。育种实践表明，优良的不育系和恢复系应该符合以下要求。

4.1.1 对不育系的要求 细胞质雄性不育是由保持系保持的，换言之，不育系的繁殖是由保持系提供花粉实现的。因此，一个稳定的不育系是以保持系为轮回亲本通过反复回交而获得的，其细胞核与保持系基本相同；即，有什么样的保持系，就会有什么样的不育系。目前，陆地棉或海岛棉品种（系）均可用作棉花细胞质雄性不育系的保持系[3,9-10]。当选育成一个优良保持系后，通过与不育系反复回交5次以上，获得的不育系应符合以下标准：

（1）田间群体性状稳定，整齐一致。

（2）不育度100%，花药内无花粉或花粉全败育，且不育性稳定，不受地点和气候条件等环境因素的影响，群体不育株率100%。

（3）开花习性好，花器大，柱头明显高出雄蕊，利于昆虫授粉，也便于人工辅助授粉。

（4）异交率要高。因棉花是以自花授粉为主的常异花授粉作物，不育系本身不产生花粉；在自然条件下（不采用人工辅助授粉），主要依靠昆虫传粉，接受保持系或恢复系花粉才能结种子。因此，那些具有吸引昆虫（尤其是蜜蜂[22-23]）造访的花朵蜜腺、颜色和气味等特性的不育系，更有可能获得高的异交率。异交率高，不育系不但能得到花粉的机率高，而且得到的花粉的量也多，从而使结铃率提高和不孕籽率降低，最终获得较高的制种产量，同时也可有较高的皮棉产量。

（5）可被恢复性好。通过与恢复系杂交获得的杂种（F1）花粉育性好，且不随环境条件改变而发生花粉育性大的波动，结铃性好，不孕籽率低。

（6）配合力强。不育系与恢复系的配合力直接决定三系杂交棉的优势水平，在各种性状配合力选择中，除了选择产量、品质和抗性的特殊配合力高的不育系，也应注重选择一般配合力强的不育系。因为一般配合力好的不育系，与不同恢复系分别杂交，产生优势组合的机会更多。

（7）综合性状好。育成的不育系株型以塔型较好，叶大小适中，中下部不郁闭，通风透光性好；这样有利于昆虫造访，也便于人工辅助授粉。对生产上的主要病虫害具有较好的抗性，尤其是对枯萎病和黄枯萎病，以及棉铃虫和红铃虫的抗性突出。棉纤维品质优良。

4.1.2 对恢复系的要求 有了优良的不育系和保持系，还必须有优良的恢复系才能配制出丰产、优质、抗病、抗虫的组合，一个优良恢复系应具备以下几点：

（1）基因型应为S（RfRf）或N(RfRf)。不过，为选育方便，大多采取前者基因型。因为在恢复系种植过程中可能会引起生物学污染（非恢复系花粉传入），这时S（RfRf）因外来花粉污染会使其基因型转变成S（Rfrf），次年会分离出不育株，从而通过发现不育株可确认恢复基因的流失（Rf变为rf）；但是，N（RfRf）基因型在种植过程中若发生恢复基因流失，在表型上是不能发现的，因为它的细胞质是可育型（N）。

（2）如果恢复系基因型是S（RfRf），要求恢复基因（Rf）效应大，即雄蕊表现为花丝较粗长、花药大、散粉多的单株。

（3）恢复力要强。恢复系的恢复力是通过与不育系杂交，从F1花药的育性或植株的结铃率表现出来的。凡是恢复系具有强的恢复力，由它配制的杂种F1，花药大、散粉好、结铃率高，达到大田生产的要求，而且受环境条件的影响很小。

（4）具有标记性状，便于去杂保纯[24]。在基因型上，恢复系S（RfRf）不同于保持系N（rfrf），但在表型上，两者几乎是一样的，难以区分。为了从表型上能观察到S（RfRf）与N（rfrf）间的明显差异，避免混杂（如：田间种植时的生物学污染，晒花轧花时的机械混杂），恢复系最好带有标记性状。标记性状应易于肉眼观察，且是隐性或不完全显性基因控制的性状（如：无腺体、鸡脚叶等）。例如：用无腺体标记的恢复系，因无腺体是受2个隐性基因（glgl）控制的性状，当恢复系繁殖田中混入有腺体植株（GlGl/GlGl）时，或传入有腺体花粉（GlGl）时，在当代或下代就可看到杂株（有腺体）的混入，只要将杂株拔除就可保持恢复系纯度。由此可见，此处的标记性状起到了指示恢复系“真”或“伪”的作用，在三系杂交棉制种和繁种的生产过程中保证种子的质量（种性和纯度）具有重要意义。除了用形态性状来标记恢复系外，也可用DNA分子标记来标记恢复系[25]。

（5）配合力要强。恢复系的配合力也是通过其杂种F1反映出来。要求它与不同不育系配组合，能表现出强的一般配合力和特殊配合力。一般配合力强表明某个恢复系与群多不育系杂交均能表现出强的杂种优势；相对应地，特殊配合力强说明该恢复系只与专一不育系杂交才显示出强的杂种优势。显然，一般配合力强的恢复系被应用更广，价值更高。

（6）农艺性状好。恢复系除了有强的恢复力，综合农艺性状好对于选配强优势组合很重要，关系到三系杂交棉的高产、优质和抗性。一般来说，一个强优势组合，亲本之一往往为高产亲本，另一亲本是优质亲本或抗逆亲本。所以，恢复系的农艺性状要接近目前推广的常规品种，使主要经济性状，如：结铃率、每亩总铃数、铃重、衣分、纤维品质和抗病虫等性状，要与不育系性状互补。

（7）与不育系有较大的遗传差异。杂种优势的强弱与双亲细胞核的遗传差异大小存在一定的相关性。一般而言，在一定范围内不育系与恢复系间的遗传差异愈大，其杂种一代的优势就愈强，反之，优势就不会很明显。

4.2 三系杂交棉的制种

有了优良的不育系和恢复系，通过大量配组（配制杂交组合）和筛选便可获得强优组合——三系杂交棉，其2个亲本——不育系和恢复系便可用于制种。三系杂交棉制种一般要求如下[3]：

4.2.1 选择棉花异交率高、隔离条件好的棉田

棉花是常异花授粉作物，花粉粒较大，直径超过120 μm，不易借助风力传粉，主要借助昆虫传粉。棉花田中的传粉昆虫约有20余种，其种类和数量随环境条件的变化而变化，使棉花的自然异交率变幅很大。通常，棉花的自然异交率为3%—10%，有时，异交率可达20%—50%。在一些特定条件下，若传粉媒介丰富，甚至高达80%。要提高三系杂交棉的制种产量，即从不育株上获得更多的种子，必须人为地提高不育系与恢复系间的异交率。这时必须选择棉花异交率高、隔离条件好的棉田。一般应符合以下条件：

（1）隔离条件

周边无棉花种植 制种田周边无其他棉花种植是最好的自然隔离条件，也是最简单的隔离措施。一般选择非植棉区的田块进行制种，可保证三系杂交棉的种子纯度。若一定要在棉区制种，也应保证在制种田周边2 km内无棉花种植。

用非蜜源植物隔离 这是考虑到蜜蜂采蜜有喜好性。蜜蜂对棉花蜜源虽有喜好，但不是最喜好。为迫使蜜蜂集中于不育系与恢复系花朵间传粉，在制种田附近应该没有比棉花更能吸引蜜蜂的蜜源植物，否则，蜂群因喜好，放弃棉花而去造访其他植物。

用纱网隔离 纱网是指能阻止昆虫穿过但能通风透光的尼龙网。用纱网隔离的优点是被隔离的棉花不受外界传粉媒介的影响，适合于在棉区进行小规模的制种，或制种比较试验[26]。例如，因科研需要，制种组合多、而所需种子量不多的情形，可用纱网隔离成若干网室进行制种。但这种隔离成本较高；另一方面，因网室内通风透光较差对棉花生长发育有一定影响，而且对一些小昆虫的隔离不一定有效。为此，选择适当网孔大小是值得考虑的因素。

（2）提高异交率条件

在与其他棉花隔离条件下，提高制种田中不育系与恢复系的异交率，是保证制种产量较高的关键。因此，选择高异交率的地点，是布置制种田的指导思想。

在村庄附近 很多村庄有养蜂的习惯，或曾经养过蜂，使周边有较多的家养或野生蜜蜂。选择此类村庄的附近的田块作为三系杂交棉的制种田是可行的。但此类村庄往往有较多的蜜源植物，为了避免制种田中的蜜蜂被它吸引走，还需要选择相对较少蜜源植物的村庄为佳。或者，棉花开花期与其他蜜源植物的泌蜜期（开花期）适当错开。例如，大多数果树开花期早于棉花，待蜜蜂对前者采蜜结束后转入棉花采蜜，是棉花借助蜜蜂传粉的合理选择。

在水源附近 一般池塘、溪、河边的田块较湿润和凉爽，不但有利于棉花生长和发育，也是适宜蜜蜂活动，在这类田块上制种往往产量较高。

昼夜温差较大的地点 棉花泌蜜属于高温型，泌蜜适温为35℃左右，昼夜温差大泌蜜更多，更适合放养蜜蜂采蜜和传粉。如在新疆吐鲁番，降雨量少，昼夜温差相当大，有利于棉花的有机物质的积累，因而泌蜜量很多，棉花蜜产量高而稳定，单产可达150 kg。在此类地方实施养蜂与制种相结合的生产，可获得制种和产蜜的双重经济效益。

沙质中性土 棉花泌蜜受土壤条件影响最大，土壤性质不同，泌蜜量也不同，这与吸引蜜蜂传粉有关。棉花生长在沙质中性土，泌蜜丰富。在粘质土和红、黄壤上，蜜少或无蜜。因此，选择有利于棉花泌蜜的土壤作为制种田，对借助蜜蜂传粉提高不育系与恢复系的异交率也有一定的促进作用。

4.2.2 选择异交率高的不育系和恢复系

（1）蜜腺发达

不育系和恢复系，尤其是不育系，若有发达的蜜腺，有利于引诱昆虫，有利传粉，是提高三系杂交棉制种产量的重要因素。陆地棉花冠在开花时张得很开，似喇叭状，而海岛棉开得象管状喇叭。经观察，陆地棉花朵对蜜蜂的吸引力比海岛棉更强[3,22]。若在制种田放蜜蜂进行自然授粉，海岛棉需要更多的蜂只数。

（2）不育系柱头高出雄蕊和恢复系花药散粉好

不育系柱头，有的与雄蕊齐平，有的明显高出雄蕊。显然，不育系柱头突出于雄蕊，可使蜜蜂等昆虫身上带的花粉便于散落在柱头上，而且人工授粉也方便和充分。不育系雌蕊虽偏小，但功能正常，它的柱头只有在被授粉后，子房才能发育成棉铃，胚珠才能发育成种子。一个不育系的棉铃，如果正常发育，常可收获30—40粒杂种种子；但是，若授粉不充分，不育系棉铃脱落较多，或不孕籽增多；从而使棉株营养生长过旺，引起徒长和二次生长。因此，采用各种方法保证不育系柱头获得充足的花粉，是三系杂交棉制种的关键。

恢复系是为不育系提供花粉的，因此要求恢复系花朵大、雄蕊发达、花粉多、散粉好，一方面使昆虫带更多的花粉；另一方面人工授粉时采一朵花可授更多的不育系柱头。另外，恢复系必须与不育系同时开花，即：花期相遇。否则，不育系开花过早或过迟，不但使制种产量降低，而且由于不育系因没有受精的花朵多，脱落多，结铃少，往往引起营养生长过旺而徒长，制种田密闭，烂铃严重，产量更低。

（3）株型似塔形和抗虫

蜜蜂不喜好密闭的棉花群体，而且往往习惯采访上部花朵。塔形的株型，使制种田棉花通透性好，一方面利于蜜蜂采访；另一方面也方便人工授粉时寻找花朵。含有抗虫基因（如BT基因）不育系和恢复系，可少喷农药治虫，尤其在盛花期尽可能不喷农药，使蜜蜂等传粉昆虫能安全有效地为不育系授粉。

4.2.3 选择适当的不育系与恢复系的种植比例和栽培技术

（1）适当的不育系与恢复系的种植比例

根据不同授粉方式，可有较大变化。若完全由自然昆虫授粉，比例应放小，如2﹕1或4﹕1；若完全人工去雄授粉，比例就可放大，如：8﹕1或10﹕1；若自然授粉与人工辅助授粉相结合的方式，比例可为4﹕1或6﹕1等。

（2）适当的栽培技术

种植密度 为适应蜜蜂喜好，以及人工授粉的方便，不育系与恢复系的种植密度宜较稀，在土壤肥力条件好的田块更需稀植。在授粉制种过程中，如果植株生长快，可能会造成群体密闭时，可拔去部分结铃少的不育系植株，或授粉结束后（盛花期过后）拔去恢复系行。

播种时间 为使不育系与恢复系开花期相遇，播种日期可以错开，如果不育系开花期较早，先播种不育系行，留出恢复系行推后若干天再播。棉花开花期较长，不会出现严重的花期不遇的情况；所以不育系与恢复系通常是同时播种，待开花初期再做调整，如对不育系进行整技时去掉下部无效果枝（未结铃的果枝）。

合理施肥 为使制种田有良好的通风透光条件，应根据棉花生长发育进程，进行合理的施肥和灌水，严格防止徒长。尤其在棉花开花盛期，群体密闭，不但影响棉花泌蜜量和吸引昆虫传粉，也影响人工辅助授粉。

少喷农药 在需要借助昆虫传粉时，应尽量少喷农药，尤其在开花盛期，以减少对传粉媒介的危害。在非棉区设置的制种田，因前茬作物不是棉花，病虫害相对较轻，少喷农药是可行的。即使要喷，也应避开盛花期和蜜蜂出巢期。当然，完全人工授粉的制种田，不受此限制。

种植若干蜜源作物 在棉花制种田中少量种植蜜源作物，如在恢复系行中种植几株玉米，并使玉米开花期与棉花开花期相遇，一方面吸引蜂群；另一方面为蜂提供食物。但在制种田附近应该没有比棉花更能吸引蜂的蜜源植物，否则，蜂群因喜好，放弃棉花而去造访它植物。

4.2.4 选择适当的授粉方式

三系杂交棉制种是指用恢复系花粉给不育系授粉获得杂种一代种子的生产过程。授粉的方式主要有3种，即：昆虫自然授粉法、人工辅助授粉法和完全人工授粉法。制种者可依据不同的生产要求和条件，采用合适的授粉方式进行制种。

（1）昆虫自然授粉法

昆虫自然授粉法是指完全依赖于自然传粉媒介，不施加人工授粉的三系杂交棉制种法。如果制种地点有丰富传粉媒介，并配以适当的措施，自然传粉法是最简便和经济的方法，但也存在一定的风险。因为自然传粉媒介（如蜜蜂）的行为是较难控制的，受到许多环境因子的影响，不能保证棉花泌蜜能完全吸引蜜蜂于制种田中。尤其海岛棉，对蜜蜂的吸引力不大，借助自然传粉的风险更大些。显然，采用此法的关键措施是选择制种地点和吸引传粉媒介，以及合理的制种田布置和管理。

（2）完全人工授粉法

完全人工授粉法是指在缺乏自然传粉媒介的条件下，或不育系和恢复系分别种于不同田块，由人工将恢复系花粉授到不育系柱头上进行制种的方法。不育系和恢复系可在同一制种田里按比例种植外，还可分别种植，也可相隔较远的不同田块里分别种植，授粉者每天上午采集大量恢复系花朵，并带到不育系田（区）里为不育系授粉。

这种父母本分别种植方式有几个优点：一是不育系与恢复系的种植比例可大大提高，如：5—10﹕1；二是人工授粉可控性好，若授粉充分和均匀，制种产量较高；三是便于田间管理，可根据不育系和恢复系的生长发育特点，分别进行管理；四是恢复系单独隔离种植，除了为不育系提供花粉外，多余的留在恢复系上的花朵还能结纯度较高的种子，起到了繁殖恢复系的作用。

完全人工授粉法制种，虽然可不必重视通过增加传粉媒介提高父母本异交率的因素，但仍需要注意三点：一是隔离条件好，防止其它棉花花粉的传入；二是父母本种植比例适当，避免恢复系花粉的供应量过多或过少；三是父母本花期相遇，尤其海岛棉与陆地棉种间杂种的父母本因生育期相差较大，采用分期播来调节花期相遇。

（3）人工辅助授粉法

人工辅助授粉是指在自然昆虫授粉的基础上再辅以人工授粉，进一步为不育系增加花粉量，使不育系每朵花都能被授粉，是三系杂交棉制种值得推荐的一种方法。它弥补了完全靠昆虫授粉的不足，因为昆虫授粉时可能有的花朵（尤其是棉株下部阴暗面处的花朵）没有被昆虫采访过，即使采访过也不一定柱头上的花粉量是足够的。此时，昆虫访问后再辅以人工授粉，或人工授粉后再经昆虫授粉，均可起到相互弥补的作用，是昆虫授粉与人工授粉结合的方法，使不育系接受的花粉更多，更均匀，棉铃发育更好，不孕籽更少，产量更高。

另外，昆虫活动还受环境影响很大。如蜜蜂，只有在温暖晴朗的天气下，授粉工作才能有效、迅速地进行。若气温低于16℃或高于40℃，蜜蜂的飞行将显著减少，乃至停止授粉。在风速达24 km·h-1时以上时，蜜蜂的活动大大减弱；达34—40 km·h-1时，飞翔完全停止。寒冷有云的天气和雷暴雨，也会大大影响蜜蜂的飞行。严格地说，完全依赖于昆虫自然授粉会有制种产量较低的风险。所以，当昆虫活跃时可借助自然授粉，当不利天气时可辅以人工授粉，以保证高的制种产量。

由此可见，人工辅助授粉法是对昆虫自然授粉法的补充，是前面介绍的2种授粉法（昆虫自然授粉法和完全人工授粉法）的综合。因此，人工辅助授粉法制种田的布置和田间栽培管理可以参照昆虫自然授粉法，人工授粉技术可参照完全人工授粉法。当然，在具体操作时，可根据实际情况作适当调整，如不育系与恢复系的种植比例，因施加了人工授粉，可比昆虫自然授粉法中的种植比例再大些。

5 展望

生产实践已证实，基于细胞质雄性不育的3系杂交棉，虽然存在不育细胞质的负效应，如结铃率较低和不孕籽率较高的缺陷，但通过培育各类优良不育系和恢复系，进行大量配组与筛选，就有可能获得优势组合，从而克服这一负效应的。例如，王学德等[15]曾以6个不育系和5个恢复系为材料，采用NCⅡ交配设计，获得27个组合的F1，以常规品种中12（推广良种）作为对照，共28个材料进行3次重复的随机区组比较试验。结果显示，有11个组合比对照增产或持平，占总组合数的40.74%，其中有5个组合表现出强优势，其皮棉产量超对照13.33%—15.62%，达极显著水平。从中可看出，不育细胞质的负效应不是绝对的，在某些情形下是有可能减轻或克服的，首先不育细胞质对来自保持系的不同核基因型有不同的亲和力，有些保持系提供的核与不育细胞质有较高的亲和力，表现为不育系不孕籽率较低，种子生产力较高；其次不育细胞质对F1育性的影响，不同的组合有不同的反应，有些组合的花粉育性接近正常，可满足双受精的需要，结铃率较高，产量优势得以表达。这在中国水稻细胞质雄性不育的研究和利用中，也有相似之处。据报道，野败型、冈型和BT型等不育细胞质对子代的负效应也普遍存在，但通过广泛测交和筛选，育成的一些高产组合里，这些负效应并不引起杂交稻产量的明显降低，而且比推广常规稻显著增产，得以大面积推广种植。

更值得关注的是，与其他作物相比，利用棉花细胞质雄性不育的三系法制种，在杂种优势利用中具有的优点：（1）不育系为无花粉不育类型，育性不受气候等环境的影响，可保证杂种的纯度。（2）棉花开花期长达3个月，不存在制种时花期不遇的现象，制种产量有保证。（3）棉花生态适应性广，育成的组合可在各地种植，种子产业化效益明显。（4）可利用种间（海岛棉与陆地棉间）杂种优势。

可以预言，基于细胞质雄性不育的三系杂交棉是大有前途的，将是棉花杂种优势利用的主要途径。不过，中国棉花细胞质雄性不育的研究和利用起步较晚，现有的不育系和恢复系水平仍较低，有不少缺陷有待克服，需要借鉴水稻、玉米和油菜等作物细胞质雄性不育研究和利用的成功经验，加强对棉花三系材料的研究和改良，克服不育细胞质的负效应，提高不育系的繁殖力和恢复系的恢复力，以组配出强优组合。如加强不育系的细胞质基因和恢复系的核恢复基因的研究，以及细胞质基因与核基因互作的研究。

在不育细胞质基因方面，可重点研究线粒体基因，如LI等[27]通过比较不育系、保持系和恢复系的线粒体基因组，发现不育系线粒体基因组发生了大量的替换和重排，从而产生了5—6个嵌合的开放式阅读框（ORF），而且发现其中4个嵌合ORFs在不育系与可育系间有差异转录。在核恢复基因方面，ZHAO等[28]以特异性位点扩增片段测序（SLAF-seq）作为一种大规模识别新SNP的高分辨率策略挖掘棉花细胞质雄性不育的恢复基因（Rf），发现恢复系基因可能涉及20个候选基因。在细胞质基因与核基因互作方面，可通过酵母双杂交等技术研究细胞质基因表达产物与恢复基因的表达产物的互作，虽未见报道，但是切实可行，因为已有不少研究表明，与可育花蕾比较，不育花蕾存在很多基因转录水平上的差异[29-31]，如果用这些差异基因的表达产物——蛋白质进行质/核互作研究，是有可能发现一些机理上的新东西。

迄今，棉花不育系和恢复系的类型仍不多，需要进一步拓宽。除了传统育种外，还可用现代生物技术，如用CRISPR-Cas9基因组编辑技术[32-33]，（1）对现有不育系的线粒体基因组进行编辑，敲除/敲入某个（些）线粒体基因，有可能产生新的不育细胞质；（2）对现有恢复系的核基因组进行编辑，敲入多个恢复基因，有可能获得强恢复系。当然，这些基因的表达需要通过绒毡层或花粉特异启动子来调控，如朱永红等[34]用绒毡层特异启动子TA29驱动和在棉花中表达的转基因方法，在创建不育系和恢复系方面做了尝试。

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Overview of the Study and Application of Cytoplasmic Male Sterility in Cotton

WANG Xuede

(College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058)

Cotton has significant heterosis. Hybrid cotton usually can increase production in lint yield by about 15% compared with conventional self-pollinated cultivars, and also can get obvious improvement in fiber quality, disease resistance, insect resistance, adversity resistance and photosynthetic efficiency. Among some links of cotton heterosis use, the most important link is the castration in the production of hybrid seeds. At present, there are four ways for the castration, such as hand emasculation, chemical male gametocide, nuclear male sterility and cytoplasmic male sterility (CMS). The production practice showed that use of cotton male sterility could not only simplify the hybrid seed production but also save the production cost on a commercial economic scale. In particular, the way of hybrid seed production by use of cotton CMS line, maintainer line and restorer line were the most effective way since it could overcome some disadvantages in the other ways. Therefore, in this paper, the study and application of the cotton CMS system in hybrid seed production were overviewed and some of problems currently limiting application were also addressed. At first, the genetic, cytological and biochemical characteristics of the cotton CMS were reviewed. Secondly, the positive/negative effects of sterile cytoplasm in hybrid F1were analyzed, and how to overcome these negative effects, such as pollen temperature sensitive and F1not expressing complete fertility, by developing strong restorer lines with a stronger ability for F1fertility restoration, was discussed in detail. For an example, transgenic strong restorer line could be developed by introducing the exogenous GST gene, which was assumed to have the function of enhancing pollen vitality, into some conventional restorer lines, and so that hybrids with higher heterosis could be produced by crossing this strong restorer with sterile lines. According to the characteristics of cotton as an often cross-pollination crop, this paper recommended in detail the key techniques of hybrid cotton seed production, such as rules of parent (sterile line and restorer line) selection, location selection and environment optimization for enriching native pollinators to produce more hybrid seeds. Then, the paper pointed out that compared with other crops, cotton hybrid seed production based on CMS system has four advantages in the cotton heterosis use: (1) The purity of hybrid seeds can be guaranteed because there is no pollen in anthers of cotton CMS line and its sterility is very stable and not affected by the climate and other environments; (2) The high yield of hybrid seed can be obtained since the long flowering period (about 3 months) of cotton does not result in the flowering asynchronismbetween sterile line and restorer line; (3) The wide ecological adaptability of cotton and the possibility of large-scale hybrid seed production will be benefited to popularize hybrid cotton; and (4) Interspecific heterosis between upland cotton (L.) and sea-island cotton (L.) can be used. It is predicted that the hybrid cotton production based on CMS system will be the main approach to utilize heterosis of cotton. Finally, the future works in study and application of CMS in cotton heterosis, especially in development of new sterile lines and restorer lines by use of modern biotechnology, was also discussed.

cotton; cytoplasmic male sterility (CMS); heterosis

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.08.005

2018-12-24；

2019-03-04

国家自然科学基金（31671763和31471567）、浙江省科技计划（2017C32077）

王学德，E-mail：xdwang@zju.edu.cn

（责任编辑 李莉）