家畜精液冷冻保存的抗氧化研究进展

王丽云，李艳华，王彦平，麻柱

（1.北京奶牛中心，北京 100192；2.农业农村部奶牛遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100192；3.奶牛遗传育种与繁殖北京市重点实验室，北京 100192）

1 氨基酸类

氨基酸是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。其中丙氨酸、半胱氨酸还具有抗氧化、抗菌、解毒等作用，在医学上用作治疗由于缺精、少精所致的男性不育症。在国外已有将半胱氨酸用作牛冷冻精液营养剂和保护剂的报道[1,2]，国内胡传活等将丙氨酸、半胱氨酸等氨基酸添加到牛冷冻稀释液中取得一定的进展[3]。

1.1 丙氨酸

丙氨酸是构成蛋白质的基本单位，在生理代谢过程担任着重要角色，作为多种活性物质的中间代谢产物，有抗疲劳、抗衰老的作用。另外，丙氨酸还是某些生物抗冻蛋白的主要成分，而抗冻蛋白可以降低体液的冰点，减少冷冻过程中冰晶的生成[4～6]。正是由于丙氨酸具有以上生理机能，胡传活等将丙氨酸添加到牛冷冻精液稀释液中后发现冷冻后精液活力有一定提高[3]。但是国内将丙氨酸作为抗氧化剂用于冷冻精液稀释液的研究较少，需要更进一步地研究加以论证。

1.2 半胱氨酸

半胱氨酸其巯基可以使蛋白质保持稳定性，具有抗氧化作用，能够在冷冻过程中保护精子质膜免受氧化损伤[7]。Bilodeau等[1]在牛冷冻精液中加入0.5μmol/L半胱氨酸结果可以使精子活力提高。有研究表明，牛冷冻精液生产过程中添加2mmol/L半胱氨酸能有效保护线粒体和精子顶体完整性。胡传活等[3]将半胱氨酸添加到牛冷冻精液稀释液中，结果精子活力未有明显提高，但精子畸形率显著低于对照组。关于添加半胱氨酸的时机和剂量还需要进一步探讨。

2 维生素类

2.1 维生素E

维生素E又称生育酚，是一种脂溶性维生素。维生素E对线粒体磷脂以及网状组织磷脂等有很强的亲和力，与细胞膜上的磷脂结构相结合，可阻止脂质过氧化反应的发生从而保护精子。它是一种非常有效的预防脂质过氧化反应的抗氧化剂。维生素E具有抗氧化作用，能维持精细胞膜的稳定性。赵宪林[8]研究发现，在秦川牛冷冻精液稀释液中添加一定量维生素E可以提高精液中抗氧化酶（CAT,SOD等）的活性，并能够提高精子活力和顶体完整率。另有许多研究也验证了这一结论[9,10]。

2.2 维生素C

维生素C又称抗坏血酸，是水溶性维生素，具有强还原性，其抗氧化作用是通过直接消除ROS而产生的。权富生等[11]研究表明，在绵羊冷冻精液稀释液中，添加一定浓度的维生素C有效提高了精液品质。还有研究发现，维生素C能提高精清中抗氧化酶的活性，并且能显著改善精液品质[12]。

2.3 维生素B12

维生素B12又名钴维生素，是目前发现的惟一含有金属元素钴的维生素。其通过减少组织的耗氧量，从而达到提高机体对氧的耐受性的效果。赵宪林在牛冷冻精液中添加维生素B12，发现情期受胎率有明显的提高[8]；张磊[13]也证实了这一点。姚桂东等[14]发现B族维生素能提高精子的受精能力。孙淑琴[15]发现添加维生素B12能显著提高精子的活力和顶体完整率。有研究发现将维生素B12用于牛羊的冷冻精液可以提高冻后的精子活力[16,17]。

3 酶类

3.1 过氧化氢酶（CAT）

过氧化氢酶是一种抗氧化酶。它可以减弱或消除H2O2对细胞的毒害作用，即将H2O2分解成H2O和O2，是一种组成生物体内防御体系的关键酶。过氧化氢酶广泛存在于动植物以及微生物中，其酶促反应为机体提供了抗氧化能力。研究表明，外源性过氧化氢酶的添加可阻止ROS的过氧化损伤。霍敏在绒山羊冷冻精液稀释液中添加过氧化氢酶，结果发现冻后精子活力、质膜完整率等均有显著提高[18]。

3.2 超氧化物歧化酶（SOD）

超氧化物歧化酶能将氧离子转变为弱毒性H2O2，而H2O2通过生物体内过氧化氢酶的作用分解成水和氧，以发挥其抗氧化性。余波澜等的研究表明精液中SOD的含量与精子的活力呈正相关[19]。程舸等研究发现低温保存的牛精液中超氧化物歧化酶的活性明显降低[20]，徐振军等[21]对冻前和冻后小尾寒羊精液和精子中的SOD活性精细研究，发现冷冻对SOD造成很大的损伤。因此在冷冻精液稀释液中添加外源性的SOD，能保护精子免受过氧化损伤。刘超等[22]研究结果表明，山羊精液中添加SOD能有效提高精子的活力。

4 其他

4.1 谷胱甘肽（GSH）

谷胱甘肽（GSH）是细胞内含有巯基的非蛋白化合物，它通过巯基发挥抗氧化作用，是动物体内重要的抗氧化剂和一些自由基清除剂。氧自由基对精子具有特别大的影响，而GSH可与氧自由基结合直接加以清除；有研究证明射出后精子与附睾处的精子比较，谷胱甘肽含量大大降低，如要保护体外精子就需要大量的GSH进行抗氧化作用。Stradaioli[23]研究发现谷胱甘肽能够有效提高冻后精子活力。吴大平[10]研究表明适量添加GSH可以提高地中海水牛冻精活力，保护质膜完整率并能降低精子的畸形率。

4.2 丙酮酸盐

丙酮酸盐是三大营养物质代谢的枢纽，是细胞的能源物质。丙酮酸盐具有多细胞/组织的保护功能，除了能够抗疲劳、降血脂、保护心肌，还有极好的抗氧化性。有研究表明，丙酮酸能抑制体内氧自由基的氧化作用[24]，还是一种过氧化氢清除剂，具有防止过氧化损伤的作用。国外将丙酮酸盐应用于动物精液的低温冷冻保存[25～28]的研究很多，国内的研究相对较少。胡传活等[29]在牛冷冻精液稀释液中添加丙酮酸盐发现冻精品质有一定的提高。

4.3 褪黑素（MLT）

褪黑素是一种胺类激素。褪黑素及其代谢产物可以直接清除活性氧，抑制细胞内促氧化酶活性。褪黑素是减少细胞氧化损伤最有效的物质之一，可直接通过抑制氧化反应来保护细胞膜脂质结构、核酸、蛋白质等；也可以通过激活体内过氧化物酶而间接发挥抗氧化作用。杨宝卫等研究发现褪黑素能有效降低冻后猪精子的畸形率，并能提高活力[30]。李方舟等[31]发现褪黑素能够提高低温保存的羊精液品质和存活时间。吴大平[10]研究表明，在水牛精液冷冻稀释液中，添加褪黑素可以降低精子的畸形率，提高冻后精子活力。吴美灵[32]发现褪黑素能够提高安格斯牛冷冻精液活力和质膜完整率。

5 小结与展望

抗氧化剂可利用其保持蛋白稳定性、消除过氧化氢、消除活性氧、与膜上磷脂相结合、抑制促氧化酶活性等特性来保护精子免受过氧化损伤，保持质膜完整性，降低精子冻后畸形率，提高精液冻后品质。因此添加外源抗氧化剂在精液保存应用研究中有广阔的前景，其对于加速精液冷冻保存技术的发展，提高优秀种畜的利用率都具有重大的意义。基于目前研究中所取得的一些进展，进一步深入研究，必将在冷冻精液保存技术上取得重大突破。