结核分枝杆菌异烟肼耐药性——一个不容忽视的问题

结核病是严重危害人类健康的传染病，也是我国重点防控的重大传染病之一。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)估计，2017年我国结核病患者数居世界第2位，耐多药结核病(multi-drug resistant TB，MDR-TB)/耐利福平结核病(rifampicin resistant tuberculosis， RR-TB)负担居世界第2位[1]，结核病尤其是耐药结核病对我国如期完成“终止结核病流行目标”是一个重大挑战。因此，加强结核分枝杆菌耐药性的研究尤其重要。

异烟肼和利福平是治疗结核分枝杆菌感染最重要的2个首选药物，二者均存在价格便宜、杀菌力强和副作用低的特点。目前国内外的研究热点主要集中在MDR-TB、 RR-TB以及广泛耐药结核病(extensively drug resistant tuberculosis, XDR-TB，指MDR菌株同时对一种氟喹诺酮类药物和3种二线注射类药物中的一种或多种耐药)上。然而，由于异烟肼的耐药机制更为复杂，其研究和快速分子诊断难度更大。笔者将在本文中从异烟肼耐药的流行状况、耐药机制以及耐药性的检测方法等方面讨论，以期给异烟肼耐药结核病的防控一点提示。

1 结核分枝杆菌异烟肼耐药的流行情况

异烟肼由Meyer和Mally于1912年在布拉格首次合成[2]，1952年分别被美国、德国的2个科学家团队发现具有抗结核活性，从此用于抗结核治疗[3]。在20世纪50年代早期，异烟肼主要作为单药治疗结核病，后因观察到单药使用容易导致异烟肼耐药性快速发生，从而导致了多药联合化疗方案的出现。

WHO于2014年的全球结核病报告中首次报道了利福平敏感菌株的异烟肼耐药率，根据154个国家1995-2013年报告的数据估计初治患者为8.1%，复治患者为14.0%[4]；2018年WHO报告，根据146个国家2003-2017年的数据估算该结果有所下降，初治结核患者为7.1%，复治患者为7.9%[1]。2018年WHO报告的利福平敏感菌株的异烟肼耐药率与2017年全球的MDR/RR耐药率相比，初治患者中前者明显高于后者(7.1%vs3.5%)；但复治患者前者明显低于后者(7.9%vs18%)[1, 4]。Yuen[5]通过对32个国家和地区的儿童结核病患者进行系统分析发现：儿童结核病患者中异烟肼耐药率高达12.1%，且大部分集中在西太区和东南亚地区。由此可看出，异烟肼耐药结核病在全球范围内处于一个比较严重的流行状态。

我国的结核病异烟肼耐药疫情也处于一个较严重的状态。根据我国2007-2008年开展的全国结核病耐药性基线调查结果显示，初治患者异烟肼总耐药率为16.01%，在6种检测药物中位列第2，明显高于利福平总耐药率(6.65%)；复治患者异烟肼总耐药率为38.51%，在6种检测药物中位列第1，明显高于利福平总耐药率(29.40%)[6]。据报道，我国多个省市的初治患者中异烟肼耐药率均高于利福平耐药率，如杭州市11.22%vs5.19%[7], 浙江省江山市13.7%vs4.3%[8]，广东省8.30%vs3.86%[9]。

异烟肼是结核病控制中一个非常重要的药物，该药便宜、有效而且副反应少，目前它的地位不可替代。异烟肼不仅对繁殖期的结核分枝杆菌具有杀菌作用，对静止期的结核分枝杆菌同样具有杀菌作用，因此除了治疗活动性结核病外，还常用于治疗结核分枝杆菌隐性感染，而且是少有的能通过血脑屏障的抗结核药物之一。因此，对异烟肼耐药的问题必须引起重视。Menzies D等人[10]在Meta分析文章中综述：对临床治疗方案进行校正后初始异烟肼耐药患者治疗失败和复发的发生率均明显大于全敏患者[OR值分别为10.9(95%置信区间为5.9-20)和1.8(95%置信区间为1.2-2.6)]。此外，多个地方的观察性研究[11-12]也报道了类似的结果。

由于利福平表型和基因型耐药的高度相关性以及GenXpert等分子检测技术的出现使得RR-TB的快速检测成为可能，加上利福平在结核病防控中的重要性，RR-TB快速引起结核病防控领域的重视。然而，Smith等[13]对WHO多年报告的数据进行分析后发现，在一些MDR患病率较低的国家和地区约有40%的利福平耐药患者没有对异烟肼耐药，他们认为检测异烟肼耐药性是非常必要的。中国地域辽阔，各个省市结核病控制水平有差异，在强调利福平耐药危险性或者说重要性的基础上，对异烟肼耐药的重要性问题有必要进一步探讨。

2 基因突变与结核分枝杆菌对异烟肼耐药的关系

异烟肼作用机制复杂，目前尚未完全阐明。目前主要认为异烟肼进入结核分枝杆菌后首先被过氧化氢-过氧化物酶(catalase-peroxidase, KatG)还原成具有杀菌活性的异烟酸，异烟酸与烯酰基载体蛋白InhA相结合，从而阻断细胞壁分枝菌酸的合成而发挥杀菌作用。据报道，katG和inhA启动子突变是结核分枝杆菌对异烟肼产生耐药的主要原因，然而科学家们发现异烟肼耐药的机制更为复杂，耐药相关基因突变与表型、治疗结局的关系需进一步阐明[14-18]。通常认为katG突变与结核分枝杆菌对异烟肼高水平耐药相关，inhA启动子突变与异烟肼低水平耐药相关。katG基因突变株约占异烟肼耐药菌株的50%～75%；inhA启动子突变约占10%～20%左右；oxyR-ahpC间隔区突变约占5%～10%，排在第3位，属于katG耐药性突变引起的代偿性突变[14-16]。值得注意的是，近年来一直认为与乙胺丁醇耐药性相关的embB基因突变同时被认为与异烟肼耐药性相关[17-18]。此外，目前发现还有18个基因与之有关[17]。

3 异烟肼耐药对多药耐药的影响

异烟肼耐药重要与否及其重要性如何，假设异烟肼耐药像利福平耐药是MDR的重要预兆因子，那么控制异烟肼耐药是非常重要的。据报道80%的利福平耐药株同时对异烟肼耐药，因此利福平耐药被看作是MDR的一个主要标志[19]。如此，从基因进化的角度理解，应是菌株先获得利福平耐药性，然后快速累积异烟肼耐药相关基因突变，从而发生异烟肼耐药。然而事实并非如此，多个地方的研究表明异烟肼耐药率明显高于利福平耐药率[6, 20]，显然多数结核分枝杆菌异烟肼耐药性获得提前于利福平。Mannson等[21]通过对来自5个洲的5 310株结核分枝杆菌基因组进行分析以后发现不同家系、不同地区和不同年代的MDR菌株中约有96%其获得异烟肼耐药性先于利福平耐药性，只有4%的MDR菌株其异烟肼耐药性是在利福平耐药的基础上后获得的。Hu等[22]也发现异烟肼耐药性尤其是katG315突变更容易诱发菌株对利福平耐药而形成耐多药菌株。2009年menzis等[10]在其对临床相关数据进行meta分析的综述中检验了异烟肼耐药性是否会增加其它药物耐药性获得的可能性，结果发现异烟肼耐药组获得性耐药的发生率是异烟肼敏感组的5.1倍 (95%置信区间: 2.3-11.0) 。还有多个观察性研究[23-27](未设立敏感对照组)认为异烟肼耐药结核病发展为MDR的可能性在1%～10%之间。我国也有相关研究报道，同样采用含异烟肼和利福平的方案治疗，单耐异烟肼患者比单耐利福平肺结核患者更容易发展成耐多药肺结核[28]。利用基因组数据对结核分枝杆菌群体水平上获得的相关基因突变构建系统发育树发现异烟肼耐药相关基因突变提前利福平耐药相关基因突变3～30年之间[29-31]。

4 结核分枝杆菌从异烟肼耐药到多药耐药的可能机制

4.1外排泵机制 外排泵是一类与细菌生理活动和物质代谢密切有关的膜蛋白，其在结核分枝杆菌对抗生素的耐药中也发挥了重要的作用。外排泵引起的耐药具有泛耐药性、可诱导性和低耐药性的特点。2012年，Machado等[32]报道利福平单耐药菌株以及H37Rv经异烟肼诱导后，异烟肼耐药水平升高，并引起katG438位密码子突变和katG的缺失，RT-qPCR显示mmpL7，p55，efpA，mmr，Rv1258c和Rv2459等外排泵基因的表达水平明显升高。此外，还有2个研究报告异烟肼诱导(亚抑菌浓度)培养菌株后，会导致菌株对异烟肼耐药、异烟肼耐药相关基因突变，多个外排泵基因高表达[33-34]。Colangeli等人[35-36]报道外排泵IniBAC与异烟肼和乙胺丁醇的耐药有关,该外排泵系统受转录调节子Lsr2的调节。尽管通常认为外排泵对底物无特异性，但有文献报道并不是当前应用中的抗生素都可被认为是外排泵的底物[37]，而且Li等[38-39]分别用异烟肼和利福平诱导各自的单耐药菌株后发现,前者诱导高表达的外排泵个数高于后者(14>8)(共检测35个)。以上证据表明异烟肼在结核分枝杆菌中容易诱发多种外排泵的表达。由于结核病治疗疗程长达6～24月且采用联合化疗方案，因此笔者推测异烟肼诱导外排泵过表达后，这些高表达的外排泵同时也将其它药物排出菌体外，间接形成细菌长期接触的药物浓度低于杀菌浓度的环境，有可能使结核分枝杆菌先对其它药物低耐药，接着产生耐药相关基因的突变致耐药表型的出现，其具体机制如何有待进一步研究。

4.2其它机制 Sherman等人[40]和Zhang 等人[41-42]首先发现结核分枝杆菌异烟肼耐药性与氧化应激密切相关，异烟肼进入结核分枝杆菌后需经氧化应激蛋白KatG和AhpC的作用才能发挥其活性作用。上文中提到耐多药外排泵蛋白调节系统Lsr2通过调节外排泵的表达影响异烟肼及其它药物的耐药性，多个研究还发现Lsr2可以保护结核分枝杆菌免受氧化应激的影响，氧化应激与多种抗生素耐药相关[43-44]。因此，异烟肼耐药菌株的抗氧化应激水平可能会影响到其它药物的耐药性。Saunders等人[45]认为异烟肼耐药性能够促使利福平耐药性产生而导致MDR的出现是因为利福平产生的选择压力小于异烟肼，导致利福平耐药株容易被异烟肼杀死，而异烟肼耐药株被利福平杀死相对较难，因此异烟肼耐药株能够存活并在标准治疗方案药物刺激下获得额外药物耐药性。

5 异烟肼耐药性的检测方法

目前临床上用于检测异烟肼耐药性的方法主要分为两类，一类是表型检测方法，一类为分子生物学检测方法。表型检测方法包括基于罗氏培养基的绝对浓度法和比例法，快速培养法以及微孔板法[46]。传统方法可以直接得到结核分枝杆菌对异烟肼的敏感性，方法可靠、技术成熟，缺点是需要细菌纯培养物、检测周期长，值得一提的是最近几年应用逐渐广泛的微孔板法由于缺乏密封性对实验室环境和设备的生物安全要求、实验室人员的操作技能和生物安全意识要求较高，笔者认为如果无法对单个反应板进行密封，也应该对多个板形成一个组合进行密封。分子生物学方法基于其原理，主要有反向杂交法、基因芯片法、溶解曲线法等[46]，均建立在异烟肼耐药相关基因突变的基础上，因此其敏感性和特异性均受到人们对异烟肼耐药机制认识的限制，应进一步加强异烟肼耐药机制的研究，以建立一种简单快速和可靠的药敏检测方法为临床用药提供帮助。

6 总 结

国内外异烟肼耐药性的流行及其带来的危害均是较严重的问题，但是否重要主要受当地结核病耐药性负担的影响，笔者虽然不推荐减少对MDR、RR或者XDR-TB的研究和重视，但是应该认识到异烟肼耐药同样是不容忽视的问题，应该加强对异烟肼作用机制、耐药机制、协同作用机制以及快速检测耐药性方面的研究。