人类磷脂酰肌醇聚糖A类基因突变在遗传毒性研究中应用进展

李若婉，周长慧，黄鹏程，于春荣，2，常 艳

（1.中国医药工业研究总院，国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203；2.国家药品监督管理局药品审评中心，北京 100038）

在药物非临床安全性评价中，遗传毒性评估是重要的组成部分之一。目前常用于评价化合物诱导基因突变的试验方法主要是细菌回复突变试验（Ames试验）、TK基因突变试验和转基因动物体内基因突变试验。啮齿类动物磷脂酰肌醇聚糖A 类（phosphatidylinositol glycan class-A，Pig-a）基因突变试验，是一项新的检测体内基因突变的方法，国际人用药物注册技术协调会议（The International Council for Harmonization，ICH）M7指南中已将其列为药物杂质遗传毒性试验阳性结果的追加试验。

对于人类PIG-A 基因的早期研究主要是源于阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）。PIG-A基因位于X染色体短臂，缺乏等位基因，是控制糖基磷脂酰肌醇（glycophosphatidylinositol，GPI）锚蛋白合成的基因之一。1993 年，Miyata 等[1]发现，GPI锚链蛋白（GPIanchored protein，GPI-AP）缺陷是由于PIG-A 基因异常引起，当PIG-A 基因发生突变时，细胞将不能正常合成GPI 锚，致使细胞表面GPI-AP缺失〔GPI（-）〕。研究表明，GPI 的生物合成过程在许多低等和高等真核生物中高度保守[2]，当人体细胞（如骨髓造血干细胞）或体外培养的人体细胞接触诱变剂，如基因突变诱变剂或染色体断裂剂后，可能导致PIG-A 基因发生基因沉默突变，进而引发GPI 锚合成障碍[2-3]。经过一段时间的细胞表达期后，使用特定的检测手段，如流式细胞术检测GPI-AP（表型）的有无，即可判断PIG-A 基因（基因型）是否发生突变[4]。PIG-A（啮齿类动物Pig-a）基因突变试验正是基于以上理论基础建立的一项新的基因突变检测方法[5]。

利用流式细胞术检测GPI 锚蛋白缺失的细胞频率是检测PIG-A/Pig-a基因突变最可靠和最敏感的方法。CD59（膜反应性溶解抑制物）、CD55（衰变加速因子）和BLAST-1/CD48（B淋巴细胞活化标记物）作为GPI-AP，常被用做GP（I-）的表型标记抗原[6]。由于啮齿类动物与人的种属差异性，开发人外周血以及体外培养人细胞的PIG-A基因突变试验成为近年来致突变研究的重要方向。本文对使用人血细胞和人细胞系进行PIG-A基因突变试验的研究进展进行简要综述。

1 人血细胞PIG-A基因突变检测

1.1 成熟红细胞

Dobrovolsky 等[7]开发了使用流式细胞术通过标记红细胞（red blood cells，RBC）CD59抗原检测人成熟RBC PIG-A 基因突变试验的方法。通过调查97 例健康志愿者和10 例癌症患者发现，外周血中CD59 缺陷型RBC（RBCCD59-）的平均突变频率（mutant frequency，MF）较低，约为5×10-6；女性的MF＞男性。此外，对于接受≥2种遗传毒性药物化疗的癌症患者，RBCCD59-的MF并未受到治疗的明显影响，可能的原因是联合用药的细胞毒性较单一化疗治疗更大，而遗传毒性反而较单一用药更低。Cao等[8]通过调查217 例志愿者得出相似的结果，RBCCD59-的MF与年龄和吸烟状况无明显相关性，但男性MF＞女性。该结果与Dobrovolsky等[7]研究结果相反，原因可能为人群样本的选择差异，如吸烟和性别比例等。Horibata 等[9]采用流式细胞术以CD235ab，CD59 和CD71 抗体标记RBC 的方法，分析了10 例健康志愿者和27 例癌症患者RBC 的PIG-A MF；其中，27 例癌症患者接受了16 种不同化疗药物的治疗。结果显示，健康志愿者和27例癌症患者RBC的PIG-A基因MF分别为（0.00～5.00）×10-6和（0.00～49.67）×10-6；27例癌症患者中仅2例患者表现出PIG-A 基因MF 显著升高，可能为药物化疗导致。因无患者治疗前的PIG-A MF 供参考，其PIG-A MF升高也可能与癌症类型和患者有较高背景MF有关。

1.2 网织红细胞

PNH是由于PIG-A基因突变引起的遗传疾病，在PNH 的临床诊断中，Dworacki 等[10]使用流式细胞术检测了RBC 表面的CD55 和CD59 分子，发现PNH 患者血细胞中网织红细胞（reticulocytes，RET）比例增多，由于RET比RBC更能抵抗溶血的影响，因此认为RET 比RBC 更适合用作PNH 诊断的目标细胞。同时，RET 相对于RBC 进入到血液循环中的时间较短，受到补体的攻击较少，RET 中PIG-A 突变细胞的比例也高于RBC 中突变细胞的比例[7]。Dertinger等[11]描述了一种通过检测CD55和CD59 分子表达来检测人RET 和RBC 中PIG-A MF 的方法。其通过调查52 例健康志愿者，使用免疫磁珠分离去除野生型细胞而富集PIG-A 突变表型细胞，其中RETCD59-/CD55-和RBCCD59-/CD55-的总体平均MF分别为6.0×10-6和2.9×10-6。PIG-A基因在RET中的MF始终高于其在RBC中的MF，RETCD59-/CD55-频率可更准确地反映PIG-A的MF。

1.3 白细胞

由于不同造血细胞系中GPI 锚链蛋白的表达具有差异，如果仅使用一种单克隆抗体进行标记，易导致PIG-A 基因突变诊断出现假阳性结果[12]。因此，可使用2 种不同细胞谱系和2 种不同GPI 锚链蛋白进行标记检测，以降低假阳性率，如同时评估RBC 和粒细胞表面CD55 和CD59 分子的表达[13]。RBC 表面GPI 锚链蛋白的检测易受溶血与输血的影响，粒细胞和单核细胞的检测则不受影响。因此，Rondelli等[14]通过标记CD55和CD59分子研究外周血粒细胞中PIG-A基因MF。该研究选择了142 例健康志愿者的外周血，使用双梯度离心法分离出粒细胞，以CD59，CD55，CD24，CD45 和CD11b 5 种单克隆抗体标记。流式细胞术分析结果显示，粒细胞的PIG-A MF 中位数为4.9×10-6，范围（1.0～37.5）×10-6，且粒细胞中PIG-A 基因MF 与年龄和性别无显著的相关性。

FLAER 试剂是一种嗜水气单胞菌溶素前体变异体，可以与所有白细胞的GPI 锚蛋白特异性结合，不会因不同细胞表达GPI-AP 的数量和种类不同造成差异[15]。因此，用荧光分子偶联无活性FLAER 试剂能直接标记细胞表面全部的GPI 锚蛋白，比其他表面抗原能更敏感地检测出GPI 阴性细胞，进而评价PIG-A基因MF[16]。

Brodsky 等[17]比较了FLAER 标记和CD59 抗体标记的8 例PNH 患者白细胞GPI 锚链蛋白的表达，发现FLAER 分析法比常规流式细胞术检测PNH更灵敏。Sachdeva等[18]回顾性比较了使用和不使用FLAER试剂标记进行流式细胞术筛查1004例患者PNH克隆的检测结果，发现随着FLAER的引入，使用FLAER/CD55/CD15 抗体、FLAER/CD24/CD15抗体和FLAER/CD14/CD33抗体组合标记外周血细胞、中性粒细胞和单核细胞，PNH 克隆的检出率由4.5%显著增加至9.2%。与基于CD55 和CD59 的传统测定法相比，FLAER 多参数测定法是一种用于更灵敏检测再生障碍性贫血患者中PNH克隆的方法。FLAER 检测法对PNH 的检出，同样可以用于PIG-A基因突变的检测。

上述研究表明，使用人血细胞的PIG-A 检测方法有可能成为临床基因突变检测的方法之一，但需要以大量人群为基础的研究进行验证。

2 人细胞系PIG-A基因突变检测

最近已有报道，在体外人成淋巴TK6 细胞和MCL-5 人淋巴细胞中成功建立了PIG-A 基因突变试验，用于体外诱变剂的检测。TK6 细胞是起源于人造血系统的悬浮培养细胞，P53蛋白功能完整，在遗传毒性试验中具有高灵敏性和高特异性，可以减少试验的假阳性结果[19]。

Krüger等[20]采用B淋巴母细胞TK6细胞，通过对2 种GPI-AP（CD55 和CD59）以及1 种GPI 非依赖性跨膜蛋白CD19（标记淋巴细胞）染色评价了化合物甲基磺酸乙酯、环己酰亚胺、放线菌酮、吡啶以及紫外线C 的遗传毒性。结果显示，甲基磺酸乙酯、紫外线C和环己酰亚胺组诱导的GP（I-）频率较阴性对照组显著增加，并呈浓度依赖关系；吡啶和放线菌酮组GPI（-）频率相对于阴性对照组未增加。上述试验结果表明，使用TK6细胞以PIG-A基因为生物标志物进行的体外致突变试验方法是可行的。同时，他们将以气单胞菌溶素为选择剂的有限稀释克隆法与流式细胞术检测PIG-A 突变的方法进行对比，验证了流式细胞术在快速定量检测PIG-A基因突变的适用性。

Rees等[3]建立了基于TK6细胞、MCL-5和AHH-1人成淋巴样细胞的流式细胞术检测PIG-A基因突变的方法。结果发现，TK6细胞本身具有较高GP（I-）频率，而MCL-5细胞本身具有代谢活性以及较低的背景自发突变率，可作为TK6 细胞的替代，在体外PIG-A 基因突变试验中具有更大的优势。另外，Yuan 等[21]利用基因组编辑技术敲除PIG-A 亚等位基因（PIG-Ac.1234C＞T 突变），建立了人类诱导多能干细胞PIG-A 基因功能缺失的细胞模型，以研究PIG-A基因的亚等位基因对神经元发育的影响。该细胞模型亦可用于研究PIG-A 基因家族的突变与锚链蛋白表型的关系。

3 影响试验准确性的因素

目前已建立检测人血细胞和人细胞系PIG-A基因突变的试验策略，但均处于前期开发阶段，存在较多影响因素。

3.1 细胞系的基础突变率

PIG-A 基因突变试验系统应具有较低背景的MF，以提高检测诱变剂的灵敏度。采用TK6 细胞或其他高基础MF的细胞系进行体外PIG-A基因突变检测时，需要在试验前清除TK6细胞中预先存在的GP（I-）细胞。主要方法有流式细胞术分选、免疫吸附分离和单细胞克隆等，其中流式细胞术分选主要采用荧光标记基因突变细胞，经流式分选并分离去除基因突变细胞；免疫吸附又可分为抗体包被平皿吸附和免疫磁珠吸附。抗体包被平皿是通过抗CD55 抗体包被平皿后吸附CD55 表达细胞，洗脱后分离去除基因突变细胞；而免疫磁珠则利用具有磁性的抗荧光素微珠标记CD55 抗体连接的荧光素，再经过分选柱强磁场吸附连接有磁性微珠的细胞，而未连接磁珠的细胞则顺利通过分选柱，以此达到分离的效果。单细胞克隆法是通过无限稀释法，将单细胞接种在96 孔板中，选取形成的单克隆细胞，扩大培养后检测基础MF[3]。

3.2 细胞毒性

细胞毒性的评估与遗传毒性试验的剂量选择和试验结果的解释具有相关性，包括基因突变试验。因此，选择合适的细胞毒性评估参数，如相对细胞增加率和相对细胞倍增数，可降低对遗传毒性试验结果的误判，也可为试验持续的时间提供依据[22]。

3.3 表观遗传学

表观遗传学改变（如次甲基/超甲基化的影响）也可能导致PIG-A基因沉默，但该沉默常常被认为是背景突变中固有的事件。就PIG-A而言，这种表观遗传事件（如启动子超甲基化）的发生是非常罕见的。对健康志愿者粒细胞中分离的GP（I-）细胞进行DNA测序，总能发现PIG-A基因的失活突变[14，23]。

3.4 基因型与表型的关系

Nicklas等[24]结合有限稀释克隆法结合DNA测序研究表明，TK6细胞系中自发突变导致的GPI-AP缺失主要是由PIG-L 基因突变导致，经甲基磺酸乙酯处理后，PIG-A 基因和PIG-L 基因的点突变增加。Krüger 等[25]应用新一代测序技术同样研究了TK6 细胞中与GPI-AP 相关的基因型与表型关系。结果表明，GPI-AP 表型缺失是由PIG-A基因突变，PIG-A mRNA完全缺乏或PIG-L基因杂合性缺失导致。PIG-A 基因型和表型的关系验证仍在进行中，这需要有效且精确的门控策略结合全基因组测序技术来判断表型丢失的原因。

4 结语

PIG-A基因可作为“哨兵”基因监测人体暴露于潜在基因毒素的体细胞突变。目前的研究发现，人类PIG-A 基因MF 存在较大的个体间差异。因此，针对人类PIG-A基因监测需要收集广泛的人群突变基础值建立数据库[11]。同时，体外培养细胞PIG-A基因突变检测方法在评估某些化学或物理因素潜在致突变性方面具有良好的应用前景。但仍需对试验所用细胞系进行广泛的表型验证，扩大验证化合物库，对试验方法的特异性、灵敏度以及实验室间可转移性进行全面评估，最终建立一个用于遗传毒性风险监管和评价的体内外高通量基因突变检测系统。