25-羟维生素D检测方法的研究进展

饶华春 粘少硕 庄跃玲

（泉州市正骨医院，福建 泉州 362000）

维生素D是一固醇类衍生物，由不同的维生素D原经过紫外线照射后形成。研究发现维生素D与人体健康关系密切，主要参与骨骼效应中的钙磷代谢，具有抗佝偻病的作用[1]；同时还与肿瘤、高血压、心血管疾病、免疫性疾病、糖尿病、哮喘及感染等疾病相关[2]。所以了解体内维生素D的含量对相关疾病的诊断非常重要。25-羟基维生素D（25（OH）D）由维生素D通过在肝脏的羟基化作用转化而来，是维生素D在体内的主要存在形式。血清内25（OH）D的含量高低与体内维生素D的储存水平是相关的，并可同时反应维生素D缺乏的症状。因此，现阶段临床上将25（OH）D作为体内维生素D含量水平的最佳指标。

1 25-羟基维生素D生物学特征

食物摄取和阳光紫外线照射皮肤是人体补充维生素D的主要方式，该方式和自身合成的维生素D经过血液循环进入肝脏，在肝脏羟化酶的羟化作用下形成25（OH）D，随后25（OH）D与α球蛋白结合经过循环系统到达肾脏并在羧化酶的作用下形成具有活性的1，25-二羟基维生素D。近些年，维生素D的生理意义越来越广，不仅参与调节钙磷代谢维持钙、磷的浓度稳定，同时还能促进肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖及诱导细胞分化等，在诸如心血管疾病、感染性疾病、神经系统疾病、肿瘤、慢性肾病及代谢综合征等各种疾病的发生、发展过程起着重要的作用。因此体内维持维生素D含量的稳定非常重要，其含量水平过低或者过高都会引发不同程度的疾病及相关症状。2010年美国医学科学院给出指导性意见，推荐血清25（OH）D浓度大于20 ng/mL有利于骨骼健康，大于150 ng/mL可能会引起中毒，不过这种现象较为罕见。据报道，目前全球缺乏维生素人口超过10亿人。

2 25-羟基维生素D检测方法

现阶段血清中25（OH）D的检测方法众多，由于25（OH）D的脂溶性以及其他代谢产物的存在使得25（OH）D的准确检测较难还没有形成统一的标准，按照检测原理主要有免疫法和色谱法。其中免疫法根据标记技术的不同又可以分为酶联免疫法、放射免疫法、化学发光法等；色谱法主要包括高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法，大量文献表明不同的技术和不同标准操作程序之间存在一定的差异。

2.1 免疫法：免疫法是目前临床检测25（OH）D的核心方法，是一种基于抗原抗体特异性结合的反应技术。1971年第一种被利用于临床检测的免疫法是竞争性蛋白结合法（CPAB），是用人工合成的维生素D与样本中的维生素D结合蛋白特异性结合，进而反推出血清中25（OH）D的含量，该方法步骤繁杂、耗费时间，无法满足临床高通量、简便的要求因而逐渐被淘汰。上世纪八十年代，放射免疫法（RIA）被研究人员关注，该方法灵敏度高、特异性强及简便易行等优点一度成为国内外检测25（OH）D的主要方法，90年代进一步优化，然而RIA由于失踪同位素的存在对操作人员有一定的放射性使得它不能广泛的应用。随着技术的发展，新的标志物和标记方法不断的被发现利用于临床诊断，目前国内使用较多的免疫法有酶联免疫法（ELISA）、化学发光免疫法（CLIA）和电化学发光免疫法（ECLIA）。ELISA是相对最早利用于临床的免疫技术，其采用酶催化反应生成有色可溶性物质对样本中成分进行标记并定量，而CLIA和ECLIA都采用发光示踪技术对靶物质进行标记，光电倍增管检测发光信号强度回算样品中25（OH）D的浓度，三种检测方法各有优劣。李光[3]在研究25（OH）D在骨质疏松诊断中的应用时采用ELISA和CLIA进行检测，结果显示两种检测方法相关性较好（r=0.86，P＜0.05），但ELISA结果离散程度大且都高于CLIA的结果，同时ROC曲线分析显示CLIA法要优于ELISA法。武姗姗[4]收集40例临床血清标本检测25羟基维生素D，用于评价ELISA法和ECLIA法的一致性。两种方法所得的结果重复性及相关性良好（r=0.994），但两组结果的预期偏差大于预设的允许误差，检测结果不一致需按照回归方程对检测结果进行调整后才具有可比性。云春风等[5]在参考了NCCLS-EP9-A2文件后对ELISA和CLIA两种方法用于检测血清25（OH）D进行了相关性和一致性研究，结果两种方法的相关系数达到r=0.981，同时研究发现随着样品浓度的升高，两种检测方法结果之间的相对标准偏差逐渐减小，该研究说明ELISA和CLIA在检测血清中25（OH）D浓度时相关性和重复性都较好。

2.2 色谱法：色谱法基本原理是利用样品混合物中各组分理化性质不同，各组分不同程度的分配到互不相溶的两相中，当两相进行相对运动时各组分在两相中反复多次重新分配最终达到分离的效果。用于血清中25（OH）D检测的主要是高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）。HPLC是较早应用的色谱法，与免疫法相比色谱法在特异性、灵敏度和准确性方面优势明显并可以同时检测25-（OH）D3和25-（OH）D2，具有分析速度快、分离效能高、重复性好、精确度高、节约成本、可自动化等特点。HPLC的不足之处是检测设备非常昂贵，所需样本量大，样品的前处理较为复杂，检测通量较小，这些因素使该方法只能在一些大型医院或高级科研院校才能使用。随着技术的发展HPLC被更加先进的LC-MS/MS逐渐代替，目前LC-MS/MS已经是检测25（OH）D最常用的色谱法技术。LC-MS/MS的检测器是串联质谱仪，可以实现分子、离子等2次质量的选择分离，是国际公认的检测金标准。同样LC-MS/MS具有HPLC相同的缺点限制了它的临床推广应用。

宋斌斌等[6]建立了LC-MS/MS定量检测血清25（OH）D的方法，利用Waters的液质联用仪参照美国食品药品管理局（FDA）的生物分析方法进行验证，结果该方法检测线性范围为6.25～500 nmol/L，批内和批间的变异系数（CV）分别＜4%和＜6%，完全符合评价标准。韩吉春等[7]以干血点为样本建立了LC-MS/MS高通量25（OH）D检测体系，该体系所需样本量仅约6 μL，整个样本前处理采用全自动化平台最终实现高通量。张旋等[8]采用化学发光法和LC-MS/MS进行性能验证和评估，两种方法在灵敏度、精密度和线性范围等方面符合性均较好。张天勇和周雪莲[9]对HPLC和ELISA检测血清25（OH）D3进行了对比实验，结果两种检测方法相关性良好但不一致，ELISA的检测结果需要按照回归方程调整后才具有可比性，存在偏差。

3 结 论

维生素D作为人类重要的营养物质与众多疾病相关，因此保证其检测结果的准确性对相关疾病的诊疗非常重要，LC-MS/MS具有灵敏度和准确性都较高的特点，是检测25（OH）D的金标准，但是碍于前期设备投入大、专业技术要求高等原因使得该技术无法大面积的推广应用，而目前化学发光技术因其自动化及高通量等特点，深受医院检验人员欢迎。随着研究的不断深入及相关技术的推广，未来25（OH）D的检测方法和仪器主要往用血量少、自动化程度及高通量等方面发展。