土壤污染生态毒理诊断方法研究进展①

王开来，苗 峰，史 柯，郭兆浩，程景颢，陈 燕

土壤污染生态毒理诊断方法研究进展①

王开来，苗 峰，史 柯，郭兆浩，程景颢，陈 燕*

(山东农业工程学院资源与环境工程学院，济南 250100)

土壤污染诊断研究对土壤污染预警和土壤污染修复效果评价具有重要的指导意义。近年来土壤污染日趋严重，污染类型呈现出复合型和多样化的趋势，传统的化学诊断法由于指标单一、样品前处理复杂且费用高已不能满足全面诊断土壤污染及评价土壤健康状况的要求。与传统的化学法相比，土壤污染生态毒理学诊断由于其灵敏度高、检测指标多样、响应快且能够从微观角度反映污染物胁迫效应，成为目前土壤污染诊断领域的热点。本文综合分析国内外文献，介绍了基于植物、动物、微生物、细胞、分子等不同层次的诊断方法并对其优缺点作了评价，同时也对其未来发展前景做出了展望。

土壤生态毒理学；生物标记物；分子诊断；组学

随着社会经济的发展，越来越多的外源性污染物通过大气、水体、生物等多种途径进入土壤环境，当其含量超过土壤环境容纳量时就会引起土壤组成、结构、功能以及理化性质的恶化，进而导致土壤环境质量、土壤肥力质量和土壤健康质量下降，甚至威胁人类和其他生物的生存与发展。据2014年《全国土壤污染状况调查公报》，全国土壤环境状况总体不容乐观，土壤污染呈加剧趋势，部分地区土壤污染严重超标，总体主要具有以下特点：①污染类型的多样化，呈现新老污染并存、无机有机复合型污染；②污染途径的多样化，大气沉降、工业三废、农业污水灌溉、畜牧养殖、农药施入，以及城市垃圾等多途径污染；③控制的难度化，由传统的污灌型向大气沉降型双向污染、点源向面源加速延伸[1-2]。目前我国土壤污染防治面临的形势十分严峻，土壤污染诊断面临许多新的挑战，单纯依靠传统的化学方法进行土壤污染诊断，已不能满足当前形势的需要，不断改进诊断方法成为土壤修复和土壤安全利用领域研究的热点[3-4]。

近年来土壤污染生态毒理诊断法受到国内外研究者的广泛关注并得以迅速发展。它通过外源污染物对受试生物(植物、动物、微生物)在分子、细胞、器官、个体、种群及群落等不同生命层次上的胁迫效应来评估土壤的污染程度。该方法阐明了有毒物质对生命有机体的危害机理，建立了污染物对受试生物的剂量-效应模型，集合了土壤中不同食物链生物对化学品的整体毒性效应，能够为土壤污染风险评估提供较详细的信息，同时也能为土壤污染修复提供可靠的依据。本文就土壤生态毒理学常用的诊断方法进行综述和展望。

1 陆生生物生态毒理学诊断

1.1 高等植物法

高等植物是生态系统中的生产者，利用其生长状况来诊断土壤污染，是土壤污染生态毒理学诊断常用的方法。其原理是通过土壤污染物对植物形态、结构、生理生化、遗传、生长等特性的影响，对种群数量、群落结构和功能以及生物多样性的改变，获取相关信息来表征土壤污染情况[5-6]。目前常采用土壤栽培(包括室外大田试验和室内栽培)、水培、滤纸法等研究方法，从污染物的剂量-反应关系、混合污染毒性与土壤营养物质浓度水平的关系等方面，探索污染物在植物体内的迁移、积累和转化规律[7-8]。符博敏等[9]通过根伸长抑制试验发现，土壤中的恩诺沙星与Cu的复合污染对白菜和西红柿两种作物的根伸长和芽伸长具有明显的抑制作用，且恩诺沙星与Cu(100、300 mg/kg)复合污染对根及芽伸长抑制效应均表现为协同作用。虽然该方法能够为重金属和抗生素复合污染土壤的早期诊断与治理提供科学依据，但此方法灵敏度低，受试植物的生长易受各种环境因素的影响，且试验周期长，操作复杂需配合精密仪器进行检测，不适合土壤污染的现场快速灵敏检测[10]。

1.2 动物诊断法

1.2.1 陆生无脊椎动物毒性试验 陆生无脊椎动物处于陆地食物链的底层，繁殖能力强，分布广，且能最大限度地接触土壤中的有害物质，其生命活动和代谢活动与土壤环境有着密切的联系，在评估土壤质量和化学污染物潜在的毒性方面具有显著优势[11]。陆生无脊椎动物种类繁多，研究者常以蚯蚓()、线虫和跳虫为指示生物，利用它们的成长试验、回避行为试验和繁殖试验来评价污染土壤的生态毒性[12]。Sillapawattana和Schäffer[13]研究了蚯蚓对吡虫啉的毒性响应，Demuynck等[14]研究了蚯蚓对重金属与有机物复合污染土壤的回避行为，这些研究表明大部分有机物、重金属的单一或复合污染均对蚯蚓产生毒害效应。虽然，目前以蚯蚓为生物标记物的研究已经日臻完善，但蚯蚓作为指示生物在污染场地的实际应用方面研究较少，且缺乏相应的评估标准。与其他无脊椎动物相比，跳虫中的白符跳对污染物更为敏感，刘玉荣等[15]研究发现抑菌灵对赤子爱胜蚯蚓的半致死浓度(LC50)高于1 000 mg/kg，而对白符跳的LC50值仅为0.072 mg/kg。虽然跳虫的种群以及群落结构、物种组成的动态变化反映了真实土壤环境的生态效应，可以更切实地对土壤污染状况进行毒性评价，但是其种群和群落结构的分布易受土壤理化性质和气象因素的影响。Dai等[16]研究了重金属对白符跳抗氧化酶及回避反应的影响，发现白符跳体内Cd含量的变化和抗氧化酶活性变化一致，其回避率和重金属含量呈正相关关系，可用来评价土壤重金属的毒性效应；但该研究同时指出土壤的理化性质会影响白符跳的抗氧化酶活性，因此在利用该生物进行土壤污染指示时应该充分考虑这些因素的影响[16]。

1.2.2 土壤原生动物毒性试验 土壤原生动物泛指生活在土壤或土壤表面凋落物中的自由生活原生动物，由于其个体简单、易于培养、繁殖速度快、分布不受地域限制、对极端环境适应性强且能够在很短的时间做出响应，是重金属和农药污染物毒性诊断较为理想的模式生物[17]。常见的土壤原生动物主要有4类：纤毛虫类、异养鞭毛虫类、裸肉足虫类和有壳肉足虫类。黄敦奇等[18]通过研究废弃农药厂污染土壤中原生动物的数量和种类发现，鞭毛虫、纤毛虫等原生动物的数量和土壤全氮含量呈正相关，肉足虫数量与土壤全磷含量有明显的正相关，且污染场地中长期残留的有机氯农药对土壤原生动物数量有明显的抑制作用。Zhang等[19]研究了梨形四膜虫()对Cu、Cd、Cr(III)和氯苯复合污染的毒性响应，发现重金属和对氯苯对四膜虫的毒害具有拮抗效应，而重金属与邻氯苯，Cu和1,2,4-三氯苯则有协同作用。然而原生动物在土壤监测中也有很多不足之处，主要表现在：①原生动物受土壤理化性质和其他环境因子的影响较大；②种类多，鉴定困难，只能粗略地估计原生动物的数量，无法把采样时活动的和形成包囊的数量区分开来；③数量大，计数费时，常会过高或过低地估计原生动物的个体丰度[20]。此外分类学上的欠缺也是阻碍土壤原生动物作为指示生物的瓶颈[21]。

2 水生生物毒理学诊断方法

2.1 藻类试验

藻类由于其培养方便、个体小、繁殖快、灵敏度高而被列入经济合作发展组织(OECD)标准水毒性监测体系，但是受藻类自身生存环境的制约应用到土壤污染生态毒理诊断的研究较少，目前多集中在田间持水量较高的南方水稻田中可持久性有机污染物(POPs)的生态毒理评估。黄健等[22]对已登记的36种除草剂进行了藻类急性毒性试验，发现抑制植物细胞分裂和作用于植物叶绿体的除草剂72 h-EC50(1.01×10–3~ 2.5 mg/L)对绿藻毒性远大于以人工合成植物生长素72 h-EC50( 3.34 ~ 143 mg/L)为代表的除草剂；此外，在作用方式相同的情况下，旱田获得登记的除草剂对藻类的毒性高于水稻田上获得登记的除草剂对藻类的毒性。目前大多数研究都是通过分析土壤提取液对污染土壤毒性进行评价，忽视了土壤原生环境对藻类的影响，检测结果会出现一定的偏差[23]。

2.2 发光菌试验

发光细菌是一种灵敏度比较高的菌种，在正常的生存环境下，细菌的荧光酶催化荧光素释放出肉眼可见的蓝绿荧光；但当受到外界不良影响时，发光菌的发光强度减弱且其强度的变化与污染物剂量或毒性强度呈剂量-反应线性关系，基于此可进行污染物毒性评价[24]。国内外对发光细菌的研究比较早，目前常用明亮发光杆菌()、费氏弧菌()、青海弧菌()对环境污染物进行检测。其中青海弧菌 (sp.-Q67)是我国学者从青海湖的青海裸鲤()体表分离出来的一种天然发光特性好、无致病性的淡水型发光菌，以该细菌为指示生物，可建立应用于水环境样品的发光毒性测试方法。Xu等[25]对比研究了青海弧菌与明亮发光杆菌和费氏弧菌对土壤中爆炸污染物提取液的急性毒性响应，发现青海弧菌对不同浓度TNT提取液的响应最敏感，且响应受暴露时间长短的影响最小，更适合作为土壤爆炸污染物的急性毒性指示生物。另外，常用方法还有Microtox 检验法[26]，但是该法对样品的pH(6 ~ 8)要求较高，超出pH范围会影响试验的效果。

2.3 大型蚤毒性试验

大型蚤作为一种常用的测试生物，具有易培养、世代短、易繁殖、产量多等优点，在工业废水、土壤及城市污泥毒性监测方面多有应用。目前，大型蚤() 是一些国际组织(如OECD 和ISO) 正式签署的唯一一种用于毒性试验的淡水无脊椎动物，常用其死亡率、繁殖率和运动抑制率来诊断土壤污染程度。然而蚤毒性试验前处理比较复杂、灵敏度低、试验时间长且关于污染胁迫对大型蚤新陈代谢系统的研究较少，对蚤毒性试验还需做进一步研究[27-29]。

3 土壤微生物毒性诊断法

3.1 微生物群落检测法

微生物群落功能的差异性对环境变化十分敏感，能够在很短的周期内做出反应，常常被用作土壤生态系统变化和土壤健康状况的早期预警和敏感指标[30]。微生物群落功能的差异通常是用反映微生物群落对含碳底物代谢功能多样性的群落水平生理特征(CLPP)来表征。目前检测土壤微生物生物量和群落结构的方法主要有磷脂脂肪酸(PLFA)分析方法、Biolog微平板法、多重底物诱导呼吸(multi-SIR)、MicroRespTM方法[31-33]。Chapman等[34]通过将MicroRespTM与Biolog平板法和multi-SIR法对比发现，MicroRespTM既保留了Biolog平板法简单易于操作和multi-SIR法利用全土的优势，同时也改进了Biolog平板法依赖土壤悬浮液提取物和细胞后续生长状况以及只能测定可培养微生物的限制和multi- SIR法自动化程度低、操作繁琐等缺点，是一种简单快捷有效的方法，常用来研究长期施肥和耕作制度对土壤微生物群落生理水平的影响。虽然有研究者也将土壤微生物生物量和群落结构做为评价土壤重金属生态毒性的生物学指标[34]，但是土壤水分、土壤pH以及土壤稀释液的浓度和稀释液中的干扰物质都会对试验结果造成影响[35]。

3.2 土壤酶活性检测法

土壤酶是土壤中产生专一生物化学反应的生物催化剂，对外源性污染物如重金属、有机污染物有明显的响应，常被用作土壤生态毒理学诊断的重要生物指标，目前主要通过监测土壤酶活性的抑制程度判断土壤污染程度，评价土壤健康质量[36-39]。Angelovi­čová等[40]发现在Cu、Zn、Pb复合污染下，随着重金属含量的增加，土壤脲酶(URE)、酸性磷酸酶(ACP)的活性受到抑制，尤其土壤脲酶受Pb、Zn的抑制更为明显。Lipińska等[41]通过测定芳基硫酸酯酶对多环芳烃(PAHs)的响应发现，在土壤弹性指数较小时，PAHs可引起芳基硫酸酯酶持续的失调。虽然土壤酶能够比较客观地评价重金属复合污染和重金属-有机物复合污染，但是由于土壤酶活性受土壤性质的影响较大，酶活性与土壤重金属含量之间的定量关系仍未完全弄清，目前土壤酶活性还不能作为重金属有效性评价的重要方法。下一步需通过深入研究土壤性质和土壤类型的差异，建立定量模型，将其与土壤重金属污染的生态风险评价结合起来[42]，促进该方法的进一步发展。

3.3 土壤呼吸检测法

土壤呼吸作用强度是衡量土壤微生物活性的重要指标，其变化能够反映土壤微生物的活跃程度，可作为表征土壤肥力和土壤质量的重要生物学指标，但专门把土壤呼吸作用作为微生物活性指标用于土壤污染生态毒理学诊断的研究是近几年来才兴起的[43-44]。现阶段土壤呼吸测定方法主要有涡度相关法、静态碱液吸收法、静态密闭气室法、动态气室法和间接检测法。静态碱液吸收法是以土壤排放的CO2总量为指标，设备简单易于操作、实验可重复性强、适于空间异质性大的土壤，但该法需人工采样，精确度不高。动态气室法虽然克服检测精度差的缺点，但是实验操作繁琐、技术要求高、设备比较昂贵；而间接检测法是通过测定土壤呼吸相关指标(如温度、水分及腺苷(ATP)含量等)推算土壤呼吸速率，只适合特定的生态系统，不具备普适性。自动气室法是在动态气室法的基础上发展起来的，在测量准确性、稳定性和使用性等方面都有所改进，受到众多研究者的青睐。周涵君等[45]利用该法发现外源添加Cd对根系土壤呼吸有明显抑制，其原因是Cd的毒害作用使土壤微生物活性显著降低且烟株根系生长缓慢，从而使土壤呼吸速率降低。随着对土壤的地域差异以及对土壤复合污染研究的逐渐深入，土壤呼吸检测法不失为一种良好的土壤生态毒理诊断方法。

3.4 土壤氮循环检测法

土壤氮循环是评价污染物对土壤微生物生态风险的重要指标，主要包括固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用[46]，其中氨氧化作用是全球氮循环的中心环节。土壤氨氧化细菌和古菌(AOB、AOA)是进行氨氧化作用的主要微生物，都含有编码氨单加氧酶(AMO)，该酶是硝化反应中氨氧化的关键酶，可将氨转化为亚硝酸盐，对土壤环境因子的变化具有潜在的指示作用[47]。李平等[48]发现向土壤中添加 Cu、Cd 等重金属离子会抑制土壤的硝化作用、反硝化作用和矿化作用，其原因主要是AOA和AOB活动受到重金属的抑制，难以进行氨氧化。此外，有研究表明有机磷、有机碳，全氮等土壤理化性质可以通过改变AOA和AOB的丰度，从而进一步影响土壤氨氧化作用，今后，为防止土壤理化性质对毒理试验的干扰，可采用控制土壤理化性质线性影响的偏相关分析方法进行研究[49]。

4 细胞水平上的生态毒理学诊断

4.1 微核试验

微核试验是一种新型的土壤污染生态毒理学诊断方法，其原理是外界土壤中有毒物质对受试生物产生毒害作用，导致其细胞染色体丢失或断裂，从而在细胞质中形成一个或多个微小核，通过观测出现的微核率来判断污染土壤的生态毒性，具有方便、快捷、高效等优点[50]，多用来检测水体污染状况和水体的致突变性。由于其微核率和染色体畸变率与农药、重金属等毒物的剂量有较好的相关性，近年来以蚕豆根尖微核试验为代表的实验方法在土壤生态毒理学诊断方面逐渐引起人们的重视。王兴明等[51]在评价煤矿区土壤重金属风险时发现，相对于蚕豆发芽率和根伸长试验，蚕豆根微核试验对重金属更为敏感。但这类方法仍涉及一些重要的方法学问题值得深入探讨和研究，比如传统的试验方法，注重观察记录处于细胞分裂间期的微核细胞，忽视了分裂期细胞的遗传损伤，没有要求记录和统计上述的染色体畸变，没有要求记录有丝分裂相的细胞数等。因此，下一步还需着重培养对污染物敏感的蚕豆品种，并结合其他手段，提高微核判断的准确度，以便更好地服务于环境监测和风险评价等领域[52]。

4.2 溶酶体中性红法

随着近年来对溶酶体结构和功能的深入研究发现，溶酶体是亚细胞水平上有毒物质的特殊靶点。蚯蚓体腔细胞内的溶酶体由于其成本低、样品处理简单、观察效果好，是目前最常用的生物标志物[53-54]。溶酶体对中性红具有很强的亲和性，蚯蚓体腔细胞内的溶酶体能很快地积累中性红染料，当有毒物质进入受试生物的细胞内时，其溶酶体膜受到损伤，导致溶酶体膜通透性改变，失去稳定性，中性红染料逐步渗透到细胞质中，根据细胞溶酶体膜中性红保持时间建立剂量-效应关系来诊断土壤污染程度。该方法具有良好的稳定性和准确性，常被用作土壤污染的早期预警[55]。Wang等[56]采用该方法分析了土壤中不同砷化物的毒性，结果表明As(III)> As(V)>单甲基胂酸盐(MMA)>二甲基胂酸盐(DMA)。Lee等[57]也通过该方法做了关于砷毒性的试验，同样得到了相似的结果。马静静[58]等通过叠加污染的方式模拟PHAs在土壤中的积累，发现PHAs的毒性与中性红保留时间存在明显的正相关关系。然而针对低剂量污染物的毒性诊断不明显，需结合其他多指标和多时段的检测，增强指示的灵敏度和有效性。

4.3 单细胞凝胶电泳试验

单细胞凝胶电泳试验又称彗星试验，是近几年发展起来的一门DNA检验技术，以其快速、简单、灵敏度高而受到广泛的关注[59]。高曦等[60]利用蚕豆为研究对象，以菲为PAHs代表物，开展彗星试验研究，以Olive尾动量(OTM)作为PAHs污染的DNA损伤效应评价参数，研究发现在0 ~ 0.6 mg/L菲污染胁迫下，蚕豆根尖细胞内的DNA受到明显的损害，且DNA损伤程度与菲胁迫呈正相关。公新忠等[61]采用彗星试验研究了6种不同浓度梯度(1 000、800、600、400、200、100 μmol/L)的铀胁迫对大豆和玉米幼苗细胞的DNA损伤程度，发现1 000 μmol/L和800 μmol/L对大豆和玉米幼苗细胞DNA的损伤情况较严重，其他浓度不明显。

5 生物标记法

5.1 解毒酶系生物标记法

解毒酶是一类具有重要生理功能的代谢酶系，广泛存在于动物、植物和微生物体内。它们易受外源污染物诱导或抑制而使其含量或活力显著增加或降低，且污染物毒性与其含量或活力之间具有显著相关性[62]，常作为毒物毒性诊断的生物标记物用于环境污染的早期诊断。目前用于土壤生态毒理诊断的解毒酶主要有细胞色素酶(CytP450)和谷胱甘肽S转移酶(GSTs)。杨晓霞等[63]通过研究蚯蚓细胞色素P450酶系不同亚酶对土壤中芘或苯并[a]芘的响应发现，芘或苯并[a]芘暴露导致蚯蚓CYPs总量、CYP1A1及CYP2C9活性的变化不同，提出了利用CYPs总量与CYP1A1活性结合或与CYP2C9活性结合来诊断土壤芘污染或苯并[a]芘污染较为准确有效。赵欢等[64]发现细胞色素P450基因表达与苯并[a]芘诱导浓度和诱导时间呈正相关。Sillapawattana等[65]从分子水平上研究了白符跳()中GSTs对吡虫啉的毒性效应，该试验为烟碱类农药毒理学试验提供了可借鉴的经验。据现有的报道，大多数研究集中在有机磷和有机氯为代表的农药方面，对其他有机污染物和重金属毒性的研究相对较少，且大多数试验仅仅停留在剂量-毒性的关系上，并没有进行分子生物学水平上的研究。此外这些研究还仅停留在实验室阶段，并没有真正用于实际污染场地的预警和监测。

5.2 抗氧化防御系统的生物标记法

抗氧化防御系统是动物体内重要的活性氧物质清除系统，当受试的好氧生物受到土壤外源污染物的胁迫时，体内的活性氧物质会增加，随着受试生物暴露时间的延长，当机体细胞内活性氧物质累积过多时，会对细胞造成伤害，严重时会导致细胞死亡。在长期的进化过程中，需氧生物形成了一套抗氧化防御体系，以减缓活性氧的损伤攻击。生物体内抗过氧化物的酶系有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等，它们含量的维持和提高是生物体耐受污染胁迫的物质基础之一，可作为指示污染土壤毒性的敏感生物标记物。唐浩等[66]发现Hg污染胁迫对蚯蚓的SOD、GSH-PX的活性具有抑制作用，而对CAT的影响无明显规律。张聪等[67]发现Pb对蚯蚓体内的SOD、CAT、POD的活性均有抑制作用，并且CAT和SOD在Pb胁迫下的活性变化趋势基本一致。此外，不同重金属污染胁迫对蚯蚓抗氧化酶活性的影响是不同的，通过研究重金属复合污染对蚯蚓的抗氧化酶活性的影响发现，Pb和Cd-Cu-Pb对SOD活性产生的影响最为显著，而Cd和Cu对谷胱甘肽硫转移酶(GST)和磷酸酯酶(AP)的活性产生的影响比较明显[68]。虽然受外源污染物胁迫后机体抗氧化系统中抗氧化酶的活性会有显著变化，但它们的改变却很难得到良好的剂量-反应线性关系，例如高浓度的污染物对酶活性的抑制并不明显。

5.3 热休克蛋白生物标记法

热休克蛋白(HSP)是机体受到外源污染物以及不良理化环境刺激后产生的一种应激蛋白，广泛存在于各类生物体内，并在生物体内发挥着重要的生理功能。作为一类高度保守的蛋白质，它可以提高受试细胞的耐受性，对生物细胞具有保护和修复作用，可作为评价外源污染物整体胁迫效应和污染程度的早期毒理学指标[69-70]。按照分子量可将其分为4个家族：HSP60、HSP70、HSP90和HSP100。其中HSP70是4个家族中最为保守的，对亚砷酸、重铬酸盐、Cd2+、Cu2+、五氯酚和林丹等污染物的胁迫响应十分显著，作为生物指标物在土壤生态毒性早期诊断方面具有很大的潜力[71]。Wang等[72]发现蚕豆中HSP70的含量在Pb胁迫诱导下从原来的125 mg/kg上升到1 000 mg/kg，比SOD、POD、APX、CAT等标记物对Pb的响应更敏感。Ezemaduka等[73]以小分子热休克蛋白(sHSP)为生物标记物，采用蛋白质免疫杂交方法，实现了重金属污染物的定量检测。

5.4 胆碱酯酶标记法

胆碱酯酶是一类专一性比较高的酶，分为乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。其中乙酰胆碱酯酶对氨基甲酸酯类农药和有机磷农药具有显著的灵敏性和较高的专一性而获到了广泛的关注和应用[74]。汪鹏鹏等[75]在研究辛硫磷和敌百虫协同污染对斑马鱼乙酰胆碱酯酶活性抑制时发现，胆碱酯酶不仅与单一污染具有明显的剂量-效应关系，而且与复合污染也具有明显的剂量–效应关系，且响应更为灵敏。此外，有学者基于乙酰胆碱酯酶修饰电极制成了灵敏度高、选择性好以及干扰小的电化学酶传感器，实现了农产品和土壤样品中有机磷农药的高选择高灵敏检测[76-77]。

6 组学在生态毒理学上的应用

土壤污染的生态毒理学诊断不仅仅局限于对单一受试物种或生物标记物的检测，还可以从更宏观的群落结构、生态系统和更微观的代谢、遗传水平上评价[78]。随着分子生物学的发展，应用宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白组学和代谢组学技术研究土壤微生物的生态功能，揭示土壤微域环境对微生物的影响机制，在评价污染土壤生态毒理学方面具有巨大的潜力。当前组学在土壤生态毒理学诊断上的应用主要表现在4个方面。

宏基因组学是在微生物基因组学的基础上发展起来的，它是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体，通过对微生物群落上DNA多态性的测量，分析污染胁迫对微生物群落结构和种群多样性的毒性效应，解决了大部分微生物因不能分离培养而难于研究的问题[79]。高通量测序和基因芯片技术是宏基因两大关键技术，与其他传统技术相比，具有很高的准确性、全面性及较高的信息深入程度。夏围围和贾仲君[80]对比了高通量测序和传统的变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱技术，发现高通量测序无论是在检测的灵敏度还是在测量微生物的丰度，以及优势种筛选中都要优于DGGE；然而DGGE能够更加直观地比较和分析微生物群落结构的变化规律，这是高通量测序技术的不足之处。与高通量测序相比，基因芯片技术具有污染物干扰和群落主要物种干扰较小的优点[81]，有学者将其应用到石油烃污染土壤微生物的生理活性和群落结构的研究中[82]。然而基因芯片技术不能够发现新的物种，也不能直接表征微生物的群落多样性和丰富度，随着16S rDNA测序技术的成熟，这一点将会得到改善。因此，在今后的研究中应该结合各种技术，取长补短促进土壤生态毒理学基因组学的发展。

宏转录组学是在宏基因组学之后兴起的一门新学科，利用RNA-Seq高通量测序技术分析受污染胁迫下的生物生理活性在时间序列上的动态变化，并获取所有可能的有毒物质对受试生物的胁迫的表达响应谱。该技术不仅具有宏基因组技术的全部优点，而且能够对微生物群落结构及代谢、功能间的关系进行剖析和监测，可直接反映实时环境表达信息。其基本流程为：①环境样品的采集与保存；②总RNA的提取；③mRNA富集；④cDNA文库的建立；⑤测序并获得大量的表达序列标签(EST)的序列，并对其进行基因功能的注释[83]。de Menezes等[84]通过转录组学研究了菲胁迫下土壤样品中微生物活性的变化，发现涉及芳香族化合物代谢及胁迫应答的转录产物显著增加。转录组学发展至今已经不在局限于土壤污染胁迫对微生物群落的影响，而是已应用到土壤污染对植物胁迫机制的研究中。Zhang等[85]通过RNA-Seq研究了Cd胁迫下甘蓝型油菜籽中金属转运蛋白基因(MTGs)，发现270个MTGs中有202个非冗余MTGs，其中108个MTGs差异表达，68个MTGs受到Cd显著的诱导作用。宏转录组学的研究工作目前尚处于初级阶段，仍存在环境样品mRNA含量低、腐植酸等干扰杂质多、rRNA去除程度有限等诸多问题有待解决[83]。

宏蛋白组学是应用蛋白质组学技术对微生物群落进行研究的一项新技术。通过研究外源化学毒物对生物体所产生的毒性效应及其导致的生物体内代谢通路的改变，可以更加全面地发现生物体内蛋白水平的细微变化及其变化之间的联系，为研究者分析污染物的毒性机制和生物体的关键蛋白防御机制提供了有力的手段。Zhang等[86]使用蛋白组学技术比较了蚯蚓()对红壤中苯并[a]芘和Cd的毒性响应，发现苯并[a]芘暴露显著诱导氧化还原蛋白的表达，而Cd暴露主要诱导参与转录和翻译相关过程蛋白质的表达；此外，还发现苯并[a]芘能明显地诱导高水平的活性氧物质(ROS)。许多污染物的毒性效应和受试生物的体内蛋白有密切的关系，单纯的从基因组学和转录组学很难细致分析污染物的毒性机制，而基于蛋白水平上的蛋白组学则具有无可比拟的优势，但是如何从环境中高效分离提取蛋白一直是制约蛋白组学发展的一个瓶颈。因此，在未来的研究中应该注重寻找具有普适性、易于操作的蛋白提取技术[87-88]。

宏代谢组学是继基因组学、蛋白质组学、转录组学后出现的新兴“组学”。通过研究机体受刺激后体液或组织中内源性代谢物的动态变化规律，并结合生物信息统计方法，系统全面地揭示内因和外因作用于机体的毒性效应和机制，为发现新的生物标志物提供了新的途径[89]。Tang等[90]通过研究红壤和潮土两种不同类型土壤下Pb和Cd胁迫对蚯蚓()代谢产物的影响，发现这两种Pb污染土壤中蚯蚓分泌物中氨基酸和核酸代谢物明显高于对照组，而甜菜碱和肌醇要低于对照组；而Cd污染红壤中蚯蚓的代谢产物变化较小，其中代谢产物较高的是一些氨基酸类物质、二甲胺、肌苷和AMP(腺嘌呤核糖核苷酸)，而组氨酸、甜菜碱、NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)等要低于对照组。代谢组学作为一种相对年轻的技术，未来应该通过与其他组学及传统的毒理学检测方法相结合，建立一套系统的污染物代谢分析方法。

与传统的生态毒理诊断方法相比，利用组学在宏基因、宏蛋白、宏转录以及宏代谢水平上进行生态毒性检测具有无可比拟的优势。然而土壤生态毒理学组学仍然受到多种因素的制约，例如如何从海量数据获取准确客观的信息，以及如何避免在提取时土壤样品不受其他因素的影响等都是需要深入研究的问题。

7 展望

近年来，土壤生态毒理学诊断在土壤重金属、有机污染物检测等方面取得了很大的进步，在土壤环境基准/阈值及生态风险评估中也发挥了重要作用，同时也为后期高效合理的土壤污染修复提供了技术支撑和理论依据。目前土壤生态毒理学诊断方法正朝着以下几个方面发展：①简单的剂量-效应关系已经不能满足检测的要求，从分子、基因、细胞水平上来探究低浓度甚至是痕量污染物的生态毒性成为未来研究的重点；②组学能够在基因水平上更深入地理解环境污染物的致毒机制，为生态毒理学寻找响应更为敏感的生物标记物提供可能，在传统的分析方法的基础上，多组学联合检测是未来土壤污染物生态毒理学诊断方法的发展方向之一；③传统的分析方法已经不能满足时代的需要，多学科交叉融合是未来土壤生态毒理学诊断方法研究和发展的一个大趋势，比如和电化学检测技术相结合制成灵敏度更高的生物传感器，同现代仪器分析技术相结合来提高诊断的准确性；④应该加强对新型污染物的环境行为及毒理效应的研究，例如微塑料、塑料薄膜、纳米银、抗生素等；⑤我国土壤种类众多，不同地区土壤之间的理化性质差异较大，因此，在进行土壤污染生态毒理学诊断时，还应该结合其他的评估方法，做到土壤污染评估的客观性。总之，随着土壤污染问题的日益突出，以及人们环保意识的增强，土壤生态毒理学诊断必将受到越来越多的环境科研工作者们的重视。

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Research Advances in Eco-toxicological Diagnosis Methods of Soil Pollution

WANG Kailai, MIAO Feng, SHI Ke, GUO Zhaohao, CHENG Jinghao, CHEN Yan*

(College of Environmental Science and Engineering, Shandong Agriculture and Engineering University, Jinan 250100, China)

Diagnosis of soil pollution has important guiding significance for early warning of soil pollution and evaluating the remediation effect. In recent years, soil pollution is becoming more and more serious and pollution type presents a complicated and diversified trend, so the traditional chemical method cannot meet the requirements of comprehensive diagnosis for soil pollution due to single detection index, complex pre-treatment, and high cost. Compared with traditional chemical methods, the ecotoxicological diagnosis of soil pollution, with high sensitivity, fast response time, combinative detection index, and the unique advantage of reflecting the pollutant stress effect from microscopic view, has become a hot spot in soil pollution diagnosis. In this paper, based on the domestic and foreign literatures, different levels of diagnostic methods based on plants, animals, microorganisms, cells and molecules are presented, the advantages and disadvantages of each method are pointed out, and the prospect is forecasted.

Soil ecotoxicology; Biomarkers; Molecular diagnosis; Omics

山东省自然科学基金项目( ZR2016CB25 )和全国大学生创新创业计划训练项目(201714439007)资助。

ychen0612@163.com)

王开来(1996—)，男，山东枣庄人，主要从事环境毒理学研究。E-mail：1252235420@qq.com

X53

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10.13758/j.cnki.tr.2019.05.003