肿瘤相关性中性粒细胞促肿瘤转移机制的研究进展*

李佳庆 王清莹 程忠平

原发性肿瘤较少导致患者死亡（肺癌和肝癌除外），多数癌症相关的死亡与转移相关的并发症有关，肿瘤细胞获得局部侵袭和转移能力为肿瘤进展的标志［1-2］。肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils，TANs）能够影响肿瘤的特性和和肿瘤微环境，促进肿瘤的侵袭和转移。本文主要介绍TANs，并分析其在肿瘤转移过程中促进肿瘤发生侵袭和转移的机制，对TANs靶向治疗肿瘤的可能性进行综述。

1 TANs

TANs是由不同的种群组成的。Sagiv等［3］对肿瘤中浸润的中性粒细胞的特征进行研究，提出中性粒细胞具有成熟的高密度中性粒细胞、成熟的低密度中性粒细胞以及未成熟的低密度中性粒细胞3 种不同的细胞群。成熟的高密度中性粒细胞具有N1表型和杀死肿瘤细胞的能力。低密度的细胞群包括未成熟的中性粒细胞和成熟中性粒细胞，具有抑制T细胞的能力。其中未成熟的中性粒细胞的特点为细胞表面CD16、CXCR1、CXCR2 表达降低，氧化活性下降；而成熟的中性粒细胞特点为细胞表面CD11b、CD66b表达增加，CD62L 表达减少［4］。TANs 与正常中性粒细胞相比具有显著性差异：TANs的寿命更长，两者共有11 035 个基因表达具有显著性差异，涉及粒细胞蛋白（如MPO、蛋白酶3 和组织蛋白酶G），协同刺激分子（如CD80，CD86），细胞因子（TNF-α），趋化因子（如TANs 的T 细胞和B 细胞趋化因子）等［5］。有研究表明，中性粒细胞在肿瘤的发生发展中具有促进或抑制肿瘤进展两个方面的作用。两种相反的作用可能是因为中性粒细胞存在抗炎（N1）和促炎（N2）的表型，依据这两种不同的表型，TANs 可以分为抗肿瘤（N1）和抑制肿瘤（N2）两种类型［6］。N1 型的TANs 能够直接通过抗体依赖的细胞毒性作用（antibody-dependent cytotoxicity，ADCC）介导抗肿瘤活性，并能够产生硝酸盐氧化物和H2O2，促炎细胞因子和刺激T细胞活化间接介导抗肿瘤活性。另一方面，N2型TANs具有高水平的精氨酸酶1（arginase1，ARG1）并能诱导产生一氧化氮合酶，抑制抗肿瘤CD8+T 细胞活性，促进肿瘤的发展［6-7］。但由于无明确的标记物来区分抗肿瘤（N1 型）和促肿瘤（N2 型）的TANs，因此对TANs亚群的识别仍具挑战，限制了其对肿瘤发展过程中TANs及其特异性作用的理解［8］。有研究利用转录组学的方法对肿瘤中N1和N2型中性粒细胞进行研究，分析中性粒细胞产生抗肿瘤或促肿瘤作用时基因和通路所发生的改变，发现两者共有9 260个基因表达具有显著性差异，涉及TANs 的许多关键功能，如吞噬（CD119、CD18 和CD209 等）、化学因子分泌（CXCL10、CXCL13、CCL17和CCL6等）、因子受体（CCR5、Gnb1、Raf-1、ERK和PTK2等）［9］。

最初招募在肿瘤发展早期阶段的TANs 为N1 表型。然而，随着肿瘤的进展，肿瘤中浸润的TANs 更加促进肿瘤发展，并获得N2表型，该表型的分化取决于环境因素［6，10］。在肿瘤微环境中某些因素可能会促使TANs 亚型的转变。目前，在小鼠模型中研究发现，转录生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和一型干扰素（interferon 1，I-IFN）为促使N1、N2型TANs转换的主要物质，阻断TGF-β能够推动TANs 从促肿瘤的N2 型向具有细胞毒性和免疫刺激活性的抗肿瘤的N1 型转化，而I-IFN 能够强烈促进TANs向抗肿瘤的N1型分化［4，11-12］。

2 TANs与肿瘤的转移

2.1 TANs对肿瘤转移的抑制

2014年，1项纳入20个研究中心，3 946例不同肿瘤患者的Meta分析表明，TANs阴性可作为肿瘤患者淋巴结转移的独立影响因素［13］。这表明TANs 可能具有抑制肿瘤转移的作用。而另有研究进一步证实在EB 病毒相关的胃癌中，高密度的TANs 能够限制胃癌的淋巴结转移［14］，提示TANs 具有抑制肿瘤转移的作用。

2.2 TANs对肿瘤转移的促进

肿瘤细胞以多种机制发生侵袭和转移：1）上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）：不仅能使肿瘤细胞获得更大的侵袭性，还能防止循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）死亡，促进肿瘤细胞外渗和继发部位的播散［11，15］；2）血管生成：血管生成是与肿瘤转移有关的一个标志。新生的血管不仅为肿瘤生长提供营养物质，而且为肿瘤细胞进入循环提供了逃逸途径［1］；3）外泌体（extracellular vesicles，EVs）的形成：EVs 为细胞间通讯的关键信使，能够调控生理和病理过程［16］。EVs可由多种细胞释放，其携带影响周围细胞活动的分子，如蛋白质、RNA、DNA、脂质和代谢物。肿瘤细胞来源的EVs 可以通过1 个“EVs 教化”的过程来改变受体细胞的行为，增强血管和淋巴管生成，推动肿瘤细胞向前哨淋巴结和远端器官转移［17］；4）免疫抑制：肿瘤细胞可以建立一种独特的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），适宜肿瘤进展。TME对肿瘤细胞最重要的一个优势为免疫抑制。如肿瘤细胞糖酵解产生的乳酸以及肿瘤细胞产生的腺苷，可抑制效应T（effector T，Teff）细胞的增殖和功能［18］；5）转移前生态龛（pre-metastatic niche，PMN）的形成：CTCs 定植到远处转移部位，为肿瘤转移关键的一步。有研究表明，原发肿瘤能够在转移的靶器官或组织创造支持肿瘤转移的微环境，即PMN［19］。而TANs能够以多种机制促进肿瘤的转移。

2.2.1 TANs能够促进肿瘤细胞进入血管 EMT不仅能使肿瘤细胞获得更大的侵袭性，还能防止循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）死亡，促进肿瘤细胞外渗和继发部位的播散［11，15］。研究表明，TANs在肿瘤EMT过程中发挥重要作用。有研究将胃癌细胞与中性粒细胞共培养后，发现中性粒细胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β 和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）显著增加并诱导了胃癌细胞EMT的发生［20］。Li 等［15］探究TANs 在胃癌细胞EMT 过程中是否发挥作用时发现，TANs 可通过产生IL17a 激活JAK2/STAT3通路，促进胃癌细胞发生EMT。此外，除了分泌炎性因子，中性粒细胞分泌的肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、TGF-β、弹性蛋白酶2（elastase2，ELA2）等均已被证明能够诱导肿瘤细胞发生EMT［11］。此外，TANs 还能够增强肿瘤细胞的迁移能力。研究发现，将食管癌细胞与TANs 来源的NE共培养48 h后，与对照组相比，食管癌细胞通过侵袭小室膜的细胞数量为对照组的25 倍［21］。TANS 分泌的酶还可以降解基膜，帮助肿瘤细胞通过基膜发生转移［22］。

2.2.2 TANs 有益于循环中的肿瘤细胞生存 TANs可以促进肿瘤细胞进入血液，并且循环中的TANs 能够抑制外周血中白细胞的活化，从而有益于侵入血管中的肿瘤细胞生存，促进肿瘤转移［22］。

2.2.3 TANs 能够促进肿瘤细胞的定植、生存和生长 原发肿瘤可以在将要转移的器官和组织部位创造一种支持转移的微环境，即PMN［19］。PMN 中的许多物质，如趋化因子（CCL2、CCL3、CXCL1、CXCL2、CXCL5和CXCL16等），脂质（如一磷酸鞘氨醇），低氧诱导的因子（如CXCL12、VEGF 和MMP9），髓样相关蛋白（如S100A8 和S100A9）等均能招募中性粒细胞至PMN［23-24］。此外，肿瘤细胞分泌的多种物质，如粒细胞克隆刺激因子（granulocyte clony-stimulating factor，G-CSF）、CXCL8、CXCLl2和EVs 等也可招募中性粒细胞至PMN［25］。提示中性粒细胞可能在肿瘤PMN的形成与维持中发挥重要作用。Wu等［26］研究发现，中性粒细胞为驱动肺PMN 形成的主要细胞成分，其能够支持肿瘤细胞更有效外渗到肺部和增殖，导致更多的肺转移。Hagerling等［6］研究显示，中性粒细胞在肿瘤细胞到达之前就积聚在肺部，中性粒细胞上的β2 整合素和Mac-1 可以通过胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM）与循环的肿瘤细胞相结合，从而使循环的肿瘤细胞锚定到转移点，促进肿瘤细胞定植。而且，招募的中性粒细胞可以产生白三烯，促进具有高致瘤能力的特定肿瘤细胞群定植。此外，招募的中性粒细胞还有助于提高肺中S100A8、S100A9和MMP9等促转移分子的水平，支持肿瘤细胞向该器官定植［24］。上述研究表明，TANs 在肿瘤PMN的构建和促进肿瘤转移中发挥重要作用。

TANs 为肿瘤免疫抑制微环境的重要组成部分，在肿瘤微环境中活化的TANs 能够通过多种机制抑制T 细胞的反应。如TANs 可以刺激T 细胞的衰竭。研究表明，在非小细胞肺癌的小鼠模型中，敲除肿瘤抑制基因STK11/LKB1，可导致中性粒细胞的积累和T 细胞的抑制；中性粒细胞释放的精氨酸酶1（arginase1，ARG-1）可以导致精氨酸的消耗，从而导致T细胞抑制；在有自发性乳腺肿瘤的小鼠中，中性粒细胞上诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表达也与T细胞抑制有关；中性粒细胞还可以产生高水平的H202抑制T细胞的增殖［24，27］。此外，在多种癌症晚期的患者中还发现CD16低表达的循环中性粒细胞。在体外模型中，CD16 低表达的中性粒细胞的诱导和激活也与T 细胞的抑制相关［4］。Wang 等［28］研究中性粒细胞在人胃癌中的性质、功能和临床相关时还发现，胃癌患者肿瘤中浸润的中性粒细胞显示出活化的CD54+表型，并表达高水平免疫抑制分子程序性死亡-配体1（programmed cell deathligand1，PD-L1），在体内外这些活化的PD-L1+中性粒细胞均能有效的抑制正常T 细胞免疫，有助于GC在体内的生长和进展。

肿瘤生长若超过1～2 mm，须有血管生成。研究发现，肝癌患者肿瘤中浸润的中性粒细胞计数和血管数呈正相关［29］。表明中性粒细胞可能与肿瘤的血管生成密切相关。肿瘤中浸润的中性粒细胞能够分泌多种物质促进血管生成，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、中性粒弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和前动力蛋白2（prokineticin-2，PROK2）等。中性粒细胞细胞内有一个大的VEGF 池，在phorbol-12-myristate 13-acetate（PMA）、fMet-Leu-Phe（fMLP）和TNF-α 刺激下会快速释放出来［30］。Hegde等［31］研究发现，在小鼠模型上阻断VEGF 后，小鼠肿瘤血管密度显著降低，肿瘤的生长减慢。此外，乳腺癌来源的粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）能够刺激中性粒细胞产生抑瘤素M（oncostatin M，OSM）上调乳腺癌中VEGF 的表达，促进肿瘤血管新生［32］。中性粒细胞来源的MMP-9 为一种高效的、直接的且不依赖VEGF 的血管生成因子。研究发现，肿瘤中浸润的MMP-9 是最初的血管生成开关。与其他产生MMP-9 的免疫细胞不同，中性粒细胞为肿瘤提供的为一种无基质金属蛋白酶的组织抑制因子（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP）的MMP-9，能更为有效地诱导血管生成［6］。PROK2为内皮细胞来源的一种强有力的有丝分裂因子，抗体抑制PROK2 能够降低肿瘤内骨髓细胞的募集和血管密度，抑制肿瘤的生长［30］。而肿瘤来源的G-CSF 已被证明可诱导中性粒分泌PROK2，促进肿瘤血管的生成［33］。

此外，活化的MMP-9和NE能够水解细胞外基质（extracellular matrix，ECM），从而提高基质中VEGF和纤维母细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）的生物利用度，而后者是存在于细胞外基质中的另一个血管生成因素［6，34］。在淋巴瘤中还发现一种TANs-基质相互作用，TANs 能够通过NF-κB 依赖的机制促进淋巴瘤基质成为可支持肿瘤进展的炎性基质［4］。

3 结语

综上所述，使用mbIL-12可以减少卵巢癌中性粒趋化因子的表达，进而减少肿瘤中TANs 的浸润和抑制肿瘤的进展。诱导肿瘤中N1 型TANs 的产生。使用大鼠肿瘤模型，敲除TGF-β 后，可诱导“N1”型TANs的产生，显著抑制肿瘤的进展和转移［35］。此外，使用I-IFN 治疗荷瘤小鼠后，诱导肿瘤中的TANs向抗肿瘤的N1 型分化，黑色素瘤患者使用I-IFN 治疗后，肿瘤中的TANs也发生了类似的分化。抑制N2型TANs 的产生。TGF-β 可以诱导N2 型TANs 的产生。有研究对小鼠系统性的使用SM16（一种特定的Alk5激酶抑制剂）发现，抑制TGF-β 的生成后，显著抑制了N2型TANs的生成［8］。上述研究结果均表明，TANs可作为一个潜在的肿瘤治疗靶点，但相关研究多停留在动物模型方面，亟需转化为临床研究，该方法有望显著提高未来肿瘤的治疗效果。