菠萝黑心病研究进展

宋康华，谷 会，张鲁斌，洪克前，贾志伟，侯晓婉

（中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/海南省园艺产品采后生理重点实验室，广东 湛江 524091）

菠萝（Ananas comosusL.Merr.）属于凤梨科凤梨属植物，是中国热带地区重要的热带水果，其效益和出口贸易情况关系到热区农民的经济收入。广东徐闻县是中国菠萝种植第一县，菠萝产量位列全国第一，其主栽品种巴厘以风味独特、果大香甜而声名远扬，但巴厘菠萝在采后贮藏和运输过程中易发生黑心病，严重影响菠萝产业和进出口贸易发展。

菠萝黑心病是采后菠萝最主要的生理性病害，采收时不发病，但发病时表现为菠萝外部无任何症状，横剖后果心周围果肉褐变，通常是小果基部或中部先出现半透明的水渍状或浅褐色的小斑点，随着发病程度的加深，褐色斑点互相联结成一片，并向果髓发展，最终果髓甚至果肉都变为黑褐色，导致果实品质劣变，失去商品价值，徐闻县主栽品种巴厘，属黑心病高感类型。前人研究认为菠萝黑心病是菠萝果实在22～25 ℃以下田间低温引起但在采后贮藏过程中发病的的生理失调病，但更多学者认为冬季菠萝果采后黑心病多由田间低温导致，而夏季菠萝果实采后黑心病则由赤霉素诱导或果实衰老引起[1]，目前所有采后处理措施只能延缓黑心病发病，不能从根本上消除黑心病，近年来随着果农对栽培措施的改进和使用激素的控制，巴厘菠萝夏季果黑心病发病率已有所降低。多年来国内外专家学者研究认为多酚氧化酶（PPO）活性升高是菠萝黑心病发病的主要原因[2]，但由于转基因技术及菠萝遗传转化体系仍不成熟，导致菠萝转基因工作开展困难，同时必要积极开展挖掘菠萝黑心病其他关键致病因子工作。

本课题组在徐闻菠萝黑心病发病规律周年不同月份调查中发现4～8月采收的果实发病率较低（≤20%），9月份后至次年3月采收的菠萝果实在采后贮藏末期黑心病发病率较高（55%～90%），严重影响了当地果农秋冬季种植菠萝的积极性和当地菠萝产业的发展。围绕菠萝黑心病的研究国内外学者已开展了30多年，本文就近年来本课题组在菠萝黑心病发病规律研究的基础上对发病机理、防治措施、存在问题及展望等方面的见解进行综述。

1 菠萝黑心病发病机理研究

菠萝果实黑心病的发病机理复杂，近年来，Kietsuda首次报道菠萝黑心病发病起源于韧皮部组织的溃败，菠萝果实中维管束组织的PPO活性，H2O2含量和酚类物质含量均为最高，且抗病品种果实较感病品种果实中含有较少的维管束数量和较多的保护性厚壁组织[1]。现从褐变机理学说、质膜结构破坏、蔗糖代谢相关酶及其他可能的机制4个方面阐述菠萝黑心病发病机理近年来的研究进展。

1.1 褐变机理学说

菠萝黑心病的主要特征是褐变，褐变的本质是邻苯二酚、表儿茶酚、儿茶酚和绿原酸被PPO氧化为醌类物质继而通过非酶促聚合生成黑色素而使组织变成褐色[2],菠萝黑心病的研究最初围绕多酚氧化酶活性、酚类物质含量和活性氧3个因素开展，周玉婵研究认为PPO是菠萝黑心病致病的关键酶，低温和GA3处理可提高PPO和PAL的活性并增加PPO底物的含量，使酶促氧化反应更易进行，导致黑心病的发生，从“无刺卡因”菠萝果实中克隆到两个PINPPO1和PINPPO2并在其启动子区域均发现了响应低温和响应GA3的元件[3]。Issaya 等[4]外源施用 437 μmol/L GA3可提高PPO酶活性从而加重菠萝黑心病的发生且内源ABA的含量可能与黑心病的抗性有密切的联系。Zhang[5]等进一步研究了赤霉素氧化酶AcGA2ox基因在低温和ABA条件下上调表达并可降低GA4+7含量进而抑制菠萝黑心病的发生,GA4+7可提高AcPPO基因的表达而外源施用ABA可抑制AcPPO的表达并显著减少菠萝黑心病的发生。除了低温和GA3通过影响PPO酶活性诱发黑心病以外，菠萝果实采后贮藏过程中总酚含量的增加也被认为是菠萝黑心病发病的主要诱因，朱惠文等[6]在比较4、10、20 ℃贮藏鲜切胡萝卜丝的总酚含量时发现较高温度（20 ℃）可促进鲜切果蔬中酚类物质的积累，这与菠萝黑心病致病温度一致，菠萝黑心病发病过程中涉及糖酸和维生素C向酚类物质转化的一系列生理生化变化，这与Yao等[7]在研究柑橘枯水病中的结论相一致。索江涛等[8]在研究猕猴桃冷害中果肉和果心不同抗冷性差异分析发现，果肉对低温更为敏感，低温可直接影响细胞膜结构和功能，形成水渍状病斑，而果心组织的褐变和木质化是抗冷过程中次生代谢产物积累的结果。活性氧也被认为是导致菠萝黑心病的重要因素之一，Luengwilai等[9]对比不同菠萝抗病和感病品种在低温10 ℃贮藏期间的代谢组发现抗坏血酸和抗氧化能力与黑心病的发生进程密切相关，而且抗病菠萝品种在贮藏过程中积累了更高水平的氨基酸、有机酸和糖类物质，同时在感病菠萝中积累更多的有毒代谢产物乳酸，而电解质渗透率和酚类物质在低温贮藏过程中变化不大，提示菠萝抗氧化物质及其抗氧化能力在预示菠萝黑心病发生中发挥重要作用，这与不同耐冷性品种桃果实上的研究较为一致[10]。菠萝属于非跃变型果实其呼吸作用尤为旺盛，在其成熟过程中面临大量的氧化胁迫，冷害的发生可能与菠萝的总抗氧化能力和APX活性密切相关。Moyle在绿熟期和黄熟期菠萝中发现了大量丰富表达的编码金属硫蛋白基因Ac180，预示其可能在清除活性氧和自由基解毒过程中具有潜在的作用。华盛顿脐橙用NO处理后放于3 ℃低温条件贮藏，以及黄瓜55 ℃热处理5 min后4 ℃贮藏均可通过提高果实的抗氧化水平从而减轻冷害[11-12]。

1.2 膜脂相变机理

细胞质膜在响应低温伤害和维持细胞稳定性扮演重要的角色，膜脂相变理论认为发生冷害的原初反应源于膜脂在冷害临界温度下由液晶态向凝胶态转变，继而引发细胞膜透性增大和细胞膜结合抗氧化酶活性的改变，最终引起生理代谢失调[13]。Zhou等[14]在比较无刺卡因菠萝在常温（25 ℃）和冷害温度（10 ℃）的电导率和ATPase酶活性发现，低温可降低ATPase活性进而导致较高的电导率加快细胞膜的渗漏,同时低温引起磷脂的减少，脂肪酸的增加，磷脂腺肌醇水平的降低以及质膜不饱和脂肪程度的降低都与膜功能损伤和黑心病的发生有密切的关系，但前人研究发现6℃以上的低温贮藏可显著降低O2-产生速率和膜脂过氧化程度,维持较高的VC含量并降低菠萝果实黑心病的发病程度。磷脂酶D可催化磷脂分解为磷脂酸（PA），在膜磷脂降解及磷脂信号转导过程中发挥着重要作用，使用磷脂酶D抑制剂正丁醇能显著降低冷藏后荔枝常温货架期间自由基的生成和细胞膜相对渗透率，提高膜脂的流动性，有效维持常温货架期冷藏荔枝的细胞膜结构，延缓荔枝果皮褐变。Hong等[15]在黑心病易感品种巴厘中鉴定了10个PLD基因，磷脂酶D抑制剂正己醛显著降低PLD基因表达和H2O2的产生，延缓和降低菠萝黑心病的发生。

1.3 糖代谢理论

广东湛江巴厘菠萝果实Vc含量冬季果显著高于夏季果，且不同月份采收菠萝果实可滴定酸含量变化规律与Vc相似，以冬季最高夏季最低，而菠萝果实可溶性糖含量的变化规律则表现出近乎相反的趋势，以夏季果最高冬季果最低[16]，以此推测可溶性糖可能与菠萝黑心病的发生有着密切的联系。在椪柑枯水病发病前后也涉及到糖酸的降解和果胶、纤维素、木质素等物质的合成[17]。己糖不仅是呼吸作用和合成的底物，而且是植物应答生物胁迫和非生物胁迫过程中重要的信号物质[18]。杜艳民等[19]比较不同可溶性固形物含量的鸭梨的耐贮性发现较高可溶性固形物含量鸭梨果实贮藏后期黑心病发生情况显著减轻，SSC与黑心指数呈显著负相关，前人也认为总糖及有机酸含量低的菠萝更易发黑心病，巴厘品种是以蔗糖积累为主的品种，且在其整个发育过程中蔗糖含量与NI活性呈极显著负相关，与SS活性和SPS活性达显著或极显著水平正相关，因此研究蔗糖积累代糖代谢相关酶协同对提高菠萝的品质和抗冷性有着极为重要的作用。比较不同季节无刺卡因菠萝糖积累的差异发现冬季果以积累蔗糖为主，且蔗糖含量与SS和SPS呈极显著的正相关，而夏季果以积累己糖为主，且蔗糖含量与AI和NI呈极显著的负相关。蔗糖及其降解产物葡萄糖和果糖作为重要的初级信号分子参与基因的表达调控，影响植物生长发育和环境应答，蔗糖转化酶（Inv）可催化蔗糖不可逆的裂解形成葡萄糖和果糖，是韧皮部卸载的关键步骤，在库器官中提高细胞壁酸性转化酶的活性有利于蔗糖在库器官中的积累，提高果实品质和抗逆性。根据亚细胞定位不同，分为细胞壁、液泡和胞质转化酶3类；根据酶的最适pH值不同，可将转化酶分为酸性和中性或碱性两类，其中细胞壁转化酶和液泡转化酶属于酸性转化酶，胞质转化酶属于中性或碱性转化酶，活性通常较低。蔗糖代谢平衡在维持膜稳定性和提高果实耐冷性方面起着重要的作用，Wang等[20]研究发现桃果实在0 ℃非冷害温度下较5 ℃冷害温度贮藏其NI、AI酶活性较低而SPS活性较高，进而含有较高水平的蔗糖和较低水平的葡萄糖和果糖含量，葡萄糖和果糖可提高果实抗氧化能力为合成AsA提供底物。5 ℃贮藏的桃果实中较10 ℃贮藏相比，蔗糖代谢相关酶活性较高，蔗糖分解活动的急剧增长显著降低了蔗糖含量并增加了还原糖含量[21]。酸性转化酶（AI）在桃果实抵御低温胁迫中具有重要作用，He等[22]在桃果实中鉴定2个液泡转化酶基因和5个细胞壁结合转化酶基因，并确认PpVIN2可响应冷胁迫并在低温贮藏蔗糖代谢过程中扮演重要角色。Xu等[23]在番茄果实中鉴定一个细胞壁转化酶抑制子基因INVINH1，番茄种子低温胁迫下抑制了该基因的转录并提高了Lin6和Lin8的表达。在番茄中沉默该基因增强了细胞壁转化酶的活性及植株的耐冷性，反之超表达INVINH1番茄植物表现为较低的细胞壁转化酶活性和对冷害更为敏感。低温会促进植物体糖代谢，通过（特别是可溶性糖）积累应对低温胁迫，增强植物抗寒性[24]。Li等[25]发现蔗糖在菠萝蜜果实成熟期大量积累，是其果实甜味的主要来源物质，酸性转化酶（AIV）在蔗糖水解起主要作用而蔗糖合酶（SuSy）在蔗糖合成中其主要作用，而外源草酸处理杏果实可通过增强其酸性转化酶活性增加果实葡萄糖和果糖含量减轻冷害[26]，Yu等[27]在不同品种桃果实研究中认为冷藏过程中蔗糖的降解速率而非采收时果实的蔗糖含量与冷害程度息息相关，进一步说明了酸性转化酶在提高果实耐冷力减轻冷害方面的重要作用。

1.4 其他可能机制

生产上表明菠萝黑心病发病率高低与果肉的pH值高低有关。冬季果可滴定酸和维生素C含量较夏季果高，果肉pH值为3.6～3.8时发生黑心病较多，pH值为3.8～4.5时，则发生黑心病较少，本课题组研究发现巴厘菠萝黑心病发病过程中柠檬酸降解同时伴随异柠檬酸和咖啡酸和表儿茶素大量积累，预示柠檬酸降解途径可能在菠萝黑心病发病过程中起着极为重要的作用，糖酸转化为酚类物质的具体代谢途径及其响应外界生物胁迫及非生物胁迫的关键因子至今尚不清楚。另有研究表明龙眼果实在常温下呼吸代谢途径以三羧酸循环为主而低温下呼吸代谢途径以戊糖磷酸途径为主，菠萝果实呼吸代谢旺盛，气调贮藏比低温贮藏在菠萝保鲜及延缓黑心病发病效果更为明显，预示呼吸代谢途径或在菠萝黑心病发病机制中有极为重要的作用。

2 菠萝黑心病防治方法研究

2.1 生长调节剂的合理使用

生长调节剂的合理使用可以改善果实品质和提高抗病性。水杨酸采前喷施和采后浸果的方式结合处理巴厘菠萝冬季果显著降低采后菠萝果实中PPO和苯丙氨酸解氨酶PAL活性，延缓了抗坏血酸水平的下降，显著降低了黑心病的发病率。1 mmol/L茉莉酸甲酯处理皇后类菠萝品种Tradsee-thong后10 ℃贮藏有效保持果实品质同时降低菠萝黑心病的发生率[28]。菠萝采收前20～30 d喷施萘乙酸溶液可有效防治菠萝黑心病，张琴等[29]采用200 mg/L 脱落酸（ABA）处理菠萝降低了多酚含量、PPO和PAL活性、活性氧和H2O2含量，以及内源活性赤霉素含量，有效降低菠萝黑心病的发生。同时由于赤霉素可诱导PPO活性升高而加重黑心病的发病，因此实际生产中要减少赤霉素的施用。乙烯利在巴厘菠萝催花和催熟方面有着重要的作用[30]，菠萝果实谢花后喷施40 μg/L乙烯利明显增加了果实可溶性固形物和可溶性糖含量，改善了果实品质。低温胁迫可诱导植株内源乙烯合成[31]，乙烯在增强植物抗逆性方面尤其是提高植株耐冷性方面发挥着重要作用[32]，但张琴等[29]采用200 mg/L乙烯利处理通过上调PPO和PAL基因表达等加重了菠萝黑心病的发生，菠萝果实发生黑心病后乙烯释放量出现下降，适宜浓度乙烯处理可显著减轻番茄[33]、香蕉[34]、桃[35]果实冷害，但低浓度乙烯对菠萝黑心病的影响至今未见报道。

2.2 采后处理

菠萝果实采收时很少发病，通常贮藏后一周开始发病，本课题组前期研究认为贮藏温度是菠萝采后黑心病发病的关键因子，20～25 ℃贮藏菠萝易发黑心病，而菠萝4～7 ℃冷藏处理可以延缓常温货架期菠萝黑心病的发生[36]，但冷藏后货架期仍不宜过长。浓度为0.2%的抗坏血酸溶液浸果后常温贮藏可显著降低菠萝黑心病的病情指数，延缓并减轻菠萝采后黑心病的发生[37]，CaCl2浸果可减轻菠萝黑心病的发病程度，Yonryon等[38]用2%CaCl2和2%CaGlu浸泡菠萝果实48 h后13 ℃冷藏，二者均减缓了低温下菠萝黑心病的发病率和发病程度，且CaGlu效果优于CaCl2。菠萝呼吸作用旺盛，研究表明气调处理可显著延缓菠萝后熟和黑心病发生，且效果优于低温贮藏，张鲁斌等[39]研究发现用10%CO2+90%N2结合15℃贮藏可显著延缓菠萝果色转黄和黑心病发生，但菠萝易发生无氧呼吸产生异味，用3%～6%O2+94%～97%N2充气于常温下贮藏可使菠萝至少40 d内不发生黑心病，并可保持较好的菠萝品质。适宜浓度的果蜡处理可显著延缓菠萝果实的成熟，降低有机酸含量和乙烯释放量，有效减轻菠萝黑心病发病程度[40]。短时厌氧处理菠萝果实后于常温下贮藏抑制了PPO活性的升高及可溶性糖含量的增加，并增加了贮藏过程中抗坏血酸的含量，维持较高的果实品质同时减轻了菠萝果实黑心病的发生[41]。MAP0.05 mm聚氯乙烯薄膜包装和高CO2浓度对控制黑心病的发生也有一定效果，但高CO2浓度对菠萝贮藏期间的品质影响仍需进一步开展相关研究，因此探寻既能有效延缓菠萝成熟衰老和黑心病发生又能防止菠萝无氧呼吸产生异味的MAP包装材料是解决生产上菠萝黑心病产生的有效途径之一。

2.4 栽培措施的调节

冬季菠萝黑心病采后措施很难完全成功控制，主要依赖于采前栽培的调整，比如在冬季种植金菠萝、卡因等非易感黑心病品种菠萝；施用有机肥控氮增钙，控制果实营养比等。喷施K2SO4和土施K2SO4混合使用显著提高了菠萝果实内果糖、葡萄糖和蔗糖含量及增加了蔗糖转化酶和蔗糖合成酶分解活性，降低了果实的蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶合成活性，促进了同化产物的运输[42]。同时施用有机肥和石灰可显著增加果实可溶性固形物、可滴定酸含量和维生素C含量，提升果实营养品质和风味，提高果实品质对增强果实耐冷力有着极为重要的作用。对于冬季栽培菠萝采后可适当早采，而春夏季栽培菠萝采收可适当推迟晚采，研究发现10月份八成熟采收的菠萝黑心病发病率显著低于六成熟的菠萝[43]。目前，重茬种植对菠萝黑心病发病影响尚无文献报道。

3 结语与展望

菠萝是一种对低温敏感的热带水果，有卡因类、皇后类和西班牙类三大品种群，现有品种大多不耐贮藏，也不耐低温，仅有皇后类的巴厘、西班牙类的武鸣、云南、台湾土种等较耐贮藏。秋冬季菠萝可解决春夏果集中上市的问题，对于黑心病目前尚无根治的方法，是限制菠萝产业发展的主要瓶颈，MAP气调是目前应用于热带果蔬最为行之有效切实可行的贮藏方式，但这依赖于未来对包装材料及其特定参数的继续探索和不断优化。目前通过秋冬季选用金菠萝、卡因等非易感黑心病品种，优化栽培管理模式提高果实品质以及采后安全有效物理化学处理方法及菠萝加工利用产业的补充，可有效减轻秋冬季菠萝黑心病给果农带来的损失，弥补秋冬季菠萝市场空白。

解决菠萝黑心病的根本途径在于品种改良，一方面通过杂交育种提高菠萝耐寒力；另一方面通过基因编辑技术对黑心病致病因子（比如PPO、PLD等基因）进行基因沉默进而对巴厘菠萝进行品种改良，同时对菠萝遗传转化体系进行不断优化，提高植株转化率。随着菠萝黑心病致病机理的不断深入以及基因编辑技术和遗传转化体系的进步和改良，必将在分子水平使菠萝黑心病得到完全控制，促进雷州半岛菠萝产业更好更优发展。