柑桔砂皮病菌鉴定及室内药剂筛选试验

何永林，黄晓琴，黎起秦，陆 温，林 纬，袁高庆

（1.广西大学农学院，广西 南宁 530004；2.玉林市农业科学院，广西 玉林 537000）

【研究意义】柑橘砂皮病又叫黑点病、树脂病、褐色蒂腐病，因各发病部位、症状、时期不同而有多种名称。过去柑橘砂皮病属于次要病害，一般结合柑橘其他病害对其进行兼治。近些年来，由于低温冻害、滥用化学药剂、管理粗放等原因，导致柑橘砂皮病发生面积逐渐增加，上升为主要病害，严重影响果实外观和品质，降低了果农的经济收入，对我国柑橘生产造成严重制约[1-2]。另外，由于不同病原间以及同种病原不同来源的菌株间对药剂的敏感性差异较大[3]。因此，筛选出适用于当地柑橘砂皮病菌的高效药剂有助于提高化学防治效果，同时增加防治药剂轮换种类，减少病原菌产生抗药性的机率。【前人研究进展】柑橘砂皮病的病原以间座壳属真菌柑橘间座壳（Diaporthe citri）为主要代表种群，无性态为柑橘拟茎点霉菌（Phomopsis citri），广泛分布于世界各大相橘产区[4-5]。但柑橘砂皮病菌种群组成复杂，不同地区病原可能不一定相同。柴思睿对江西省柑橘黑点病菌种群调查发现，除优势种D.citri之外，还有26个Diaporthe种可引起柑橘黑点病[6]。广西是我国柑橘的最大产区，当地柑橘砂皮病发生普遍, 且呈暴发趋势[7]。目前对该病的防治除了采用农业措施增强果树树势外，主要依赖化学防治。国内防治柑橘砂皮病以代森锰锌、咪鲜胺、苯并咪唑类、三唑类杀菌剂等为主[8-10]，多为传统的单剂农药，防治对象较单一且易产生抗药性。张岳等[11]对26种杀菌剂对柑橘砂皮病菌的室内毒力测定，在治疗性杀菌剂中，毒力最高的是250 g/L吡唑醚菌酯，其EC50为0.2001 mg/L；在保护性杀菌剂中，毒力最高的是80%代森锰锌，其EC50为3.3946 mg/L；周娜等[12]在测定33种杀菌剂对柑桔砂皮病菌的毒力时发现，双胍三辛烷基苯磺酸盐、氟硅唑、多菌灵、咪鲜胺锰盐、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、咪鲜胺、戊唑醇、甲基硫菌灵的抑菌效果较强，其EC50在0.0112～1.7296 mg/L之间。【本研究切入点】本研究以广西柑橘园表现典型砂皮症状的病果为试验材料，对病原菌进行分离和鉴定，通过菌丝生长抑制法测定了21种药剂对柑橘砂皮病菌的抑制作用，从中筛选出抑菌效果好且能兼治柑橘其他病害的药剂进行室内毒力测定。【拟解决的关键问题】分离并鉴定广西当地柑橘砂皮病菌菌株，筛选更适合当地的高效广谱药剂，为田间防治柑橘砂皮病提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2017年从广西桂林富川县柑橘果园采集表现典型砂皮症状的病果，从中分离获得柑橘砂皮病菌菌株，作为药剂筛选供试菌株。

供试药剂：70%代森联水分散粒剂（德国巴斯夫公司），10%苯醚甲环唑水分散粒剂（北京中发百农生物化学技术有限公司），50%咪鲜胺悬浮剂（江苏惠民农业科技有限公司），30%吡唑醚菌酯悬浮剂，25%氟环唑·噻呋酰胺悬浮剂，250 g/L丙环唑乳油（陕西美邦农药有限公司），22.5%啶氧菌酯悬浮剂（安阳市锐普农化有限责任公司），35%氟环唑·吡唑醚菌酯悬浮剂（河南豫之星作物保护有限公司），20%噻菌铜悬浮剂（浙江龙湾化工有限公司），80%代森锰锌可湿性粉剂（美国陶氏益农公司），1.8%辛菌胺醋酸盐悬浮剂（西安嘉科农化有限公司），46%氢氧化铜水分散粒剂（美国杜邦公司），12.5%戊唑醇乳油（四川省慧峰植保科技有限公司），50%氯溴异氰尿酸可湿性粉剂（河北上瑞化工有限公司），40%苯醚甲环唑·吡唑醚菌酯悬浮剂（天津万源新绿生物科技股份有限公司），40%多菌灵悬浮剂（青岛杜邦化工集团有限公司），47%春雷霉素·王铜可湿性粉剂（青岛金尔农药研制开发有限公司），30%氟环唑悬浮剂（江西千益化工股份有限公司），80%乙蒜素乳油（河南科邦化工有限公司），24%吡唑醚菌酯·壬菌铜微乳剂（陕西上格之路生物科技有限公司），40%喹啉铜·吡唑醚菌酯悬浮剂、40%喹啉铜悬浮剂（陕西康禾立丰生物科技药业有限公司），30%吡唑醚菌酯悬浮剂（陕西美邦农药有限公司）。

1.2 柑橘砂皮病菌的分离与鉴定

采用常规分离法对果实病组织进行分离，取2 mm×2 mm的砂皮病组织块，放入75 %酒精消毒30～60 s，在1%升汞溶液中消毒1 min，用无菌水漂洗3次，将组织块置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上，28℃恒温培养。将分离菌株纯化后置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）及燕麦琼脂（OMA）中28℃下培养，观察菌落培养性状、产孢结构、分生孢子形状及颜色，并测量大小。另外提取菌株的菌丝体DNA，用真菌通用引物ITS4与ITS5对菌株的rDNA-ITS序列进行PCR扩增[4]，扩增反应条件如下：预变性94℃5 min，变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，35个循环，延伸 72 ℃ 45 s，最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。扩增产物经纯化后测序并通过GenBank数据库对序列进行BLAST比对分析。结合病原菌的形态特征，确定其种类。

1.3 21种药剂对柑橘砂皮病菌的抑制作用测定

采用菌丝生长速率法初步测定药剂对柑橘砂皮病菌的抑制作用。将供试的21种药剂分别与PDA培养基混合制成含药培养基平板，每种药剂设置10、1、0.1μg/mL3个浓度梯度，每个药剂浓度3次重复。将含相同量无菌水的PDA培养基作为对照。用5 mm直径的打孔器选取供试菌株菌落边缘打孔，将菌饼带菌丝的一面向下接种到含药平板中央，置于28 ℃的光照培养箱中培养7 d，以十字交叉法测量菌落直径（mm），取其平均值，计算各药剂浓度对菌丝生长的抑制率：

1.4 5种药剂对柑橘砂皮病菌的室内毒力测定

在药剂初筛选试验基础上，筛选5种抑菌率高、抑菌谱广的新型药剂，测定其对柑橘砂皮病菌的室内毒力。针对不同药剂分别配置一系列浓度梯度，每个药剂浓度3次重复，按照上述菌丝生长速率法测定各浓度梯度的药剂对病菌的抑制率。用SPSS V20软件统计分析，将药剂浓度换算成浓度对数（x），菌丝生长抑制率换算成抑制机率值（y），计算毒力回归方程、相关系数（r）及抑制中浓度（EC50）。

2 结果与分析

2.1 病原菌的鉴定

从病果上分离获得3株形态特征一致的菌株F-3-1、F-3-2和F-3-3。菌落初期白色、稀疏、羽毛状，后期暗灰色至黑色、棉毡状，呈同心轮纹状扩展。在PDA平板上培养60 d未观察到产孢结构。在OMA上培养30 d左右，菌落产生黑色小点即分生孢子器，分生孢子器近球形，具孔口，分生孢子梗无色近圆柱型。甲型（α）分生孢子椭圆至纺锤形，单孢无色，两端各含1个油球，平均大小为8.83 μm×3.81 μm，未观察到乙型（β）分生孢子。

任选其中1株具有致病力的菌株F-3-3进行rDNA-ITS序列的PCR扩增，经测序和同源性比对，发现F-3-3菌株的rDNA-ITS序列与GenBank中的Diaporthe citri的同源性达99%。结合形态特征（图1），确定从柑橘砂皮病病果上分离得到的菌株F-3-3为D.citri，其无性阶段为Phomopsis citri。

图1 柑橘砂皮病菌F-3-3菌株在燕麦培养基上的培养性状及形态特征Fig.1 Culture characteristics and morphological characteristics of F-3-3 strain on of D.citri OMA medium

2.2 21种药剂对柑橘砂皮病的抑制作用

试验结果（表1）表明，21种药剂对柑橘砂皮病菌菌丝生长均有抑制效果，药剂对病原菌的抑制率与药剂浓度呈正相关，表现为供试药剂浓度越高，菌落直径越小，抑制率越高。当药剂浓度在最低测试浓度0.1 μg/mL时，咪鲜胺、吡唑醚菌酯、氟环唑·吡唑醚菌酯、戊唑醇、苯醚甲环唑·吡唑醚菌酯、多菌灵和喹啉铜·吡唑醚菌酯的抑菌率均达100%，氟环唑·噻呋酰胺、吡唑醚菌酯·壬菌铜、啶氧菌酯和丙环唑的抑菌率大于53%，后4种药剂的浓度增加到1 μg/mL时，抑菌率均也达到100%。以上11种药剂的离体抑菌效果较好；其余杀菌剂浓度为1 μg/mL时，抑菌率在6.6%～72.6%之间，抑菌效果一般或较差。

表1 21种药剂对柑橘砂皮病菌的平均抑制率Table 1 Average inhibition rate of 21 fungicides to D.citri

2.3 5种药剂的室内毒力

从11种离体抑菌效果好的药剂中选择5种新型的复配剂和单剂进行室内毒力测试。结果（表2）表明，5种药剂对柑橘砂皮病菌都具有很强的抑制作用，其中氟环唑·吡唑醚菌酯的毒力最高，EC50值为0.053 μg/mL；氟环唑·噻呋酰胺的毒力最低，EC50值为0.814 μg/mL。5种供试药剂对柑橘砂皮病菌的抑制作用从高到低依次为：氟环唑·吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、喹啉铜·吡唑醚菌酯、吡唑醚菌酯·壬菌铜和氟环唑·噻呋酰胺。

3 讨论

阳廷密等曾确认广西金柑新发现的黑点病病原亦为柑橘间座壳[13]。本研究和已知文献表明，广西柑橘砂皮病、黑点病、褐色蒂腐病和树脂病病原的优势种为D.citri[4]，这与其他柑橘产区的研究结果一致。不过另据报道，除了D.citri外，广西柑橘上间座壳菌相关致病菌还包括D.citrichinensis，但其并不能引起砂皮症状[4]。广西柑橘种植面积大，分布范围广，种类多，本试验采集标样有限，当地柑橘砂皮病是否仅由D.citri引起尚待深入研究。

表2 5种药剂对柑橘砂皮病菌的室内毒力Table 2 Toxicity determination of 5 fungicides on D.citri in laboratory

本试验通过菌丝生长抑制法对21种药剂进行初筛选，发现这些药剂普遍对柑橘砂皮病菌有抑制作用，其中三唑类和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的抑菌效果总体上较好。目前国内对柑橘砂皮病药剂筛选的报道以咪鲜胺、代森锰锌、苯并咪唑类和三唑类杀菌剂等单剂为主[8-10]，前人已验证上述杀菌剂大多对柑橘砂皮病菌菌丝生长有很强的抑制作用，EC50值范围为1.089×10-3～0.954 μg/mL[8,10,14-15]。田间防治效果较好的药剂有代森锰锌、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑等[15-16]。苯并咪唑类、三唑类杀菌剂高效广谱，具有保护和治疗作用等优点，但作用靶标单一，大量单独使用后病菌易产生抗药性，且对其他杀菌剂也会产生交互抗性[17-18]。美国对柑橘黑点病的防治过去主要以铜制剂为主[19]，近年来也开始推广使用甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，如吡唑醚菌酯和嘧菌酯等[20]。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是一类高效、低毒、广谱的内吸性杀菌剂，与其他杀菌剂不存在交互抗性，能有效的控制已经对其他杀菌剂产生抗性的植物病害。近年来国内在防治柑橘砂皮病时也逐渐重视该类杀菌剂[11]，本试验的测试也进一步证实啶氧菌酯、吡唑醚菌酯以及吡唑醚菌酯与氟环唑或苯醚甲环唑的复配剂对柑橘砂皮病菌均有较强的抑制作用。但甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对细菌性病害无效，而溃疡病是严重制约柑橘生产的一种细菌性病害，防治该病的主要药剂为铜制剂，分别施用药剂会增加防治成本及农药残留。本试验测定吡唑醚菌酯与喹啉铜和壬菌铜的复配剂对柑橘砂皮病菌的EC50值分别为0.064 μg/mL和0.106 μg/mL，抑菌效果十分明显。另外，吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、氟环唑对柑橘柑橘炭疽病和疮痂病也有较好的防治效果[21-23]，因此，本试验选用的复配剂能有效地增加药剂抑菌谱，在防治柑橘砂皮病的同时，还可能兼治柑橘溃疡病、炭疽病等其他多种病害。本试验还发现，氟环唑浓度为1 μg/mL时对柑橘砂皮病菌的抑制率为67.7%，但其与噻呋酰胺的复配剂在同样浓度下对病菌的抑制率达到100%。噻呋酰胺内吸性强、持效期长，主要用于防治纹枯病和白绢病，目前尚未见有噻呋酰胺应用于柑橘病害的研究报道，其单剂及复配剂对柑橘砂皮病的防治作用有待进一步研究。

4 结论

结合形态特征观察和rDNA-ITS序列分析，鉴定广西柑橘砂皮病病原为柑橘间座壳（Diaporthe citri）；三唑类和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对柑橘砂皮病菌的抑菌效果总体上较好，吡唑醚菌酯·壬菌铜、氟环唑·噻呋酰胺、喹啉铜·吡唑醚菌酯、氟环唑·吡唑醚菌酯和啶氧菌酯等5种杀菌剂的EC50范围为0.053～0.814 μg/mL，为田间防治柑橘砂皮病时选择更多轮换药剂提供了参考。