针刺调控脑缺血再灌注损伤后内质网应激机制的研究进展*

孙晓伟，王新宇，孙忠人，刘 昊，王 博,张 菶，刘 丹，刘 勇，陈英华，金 弘，李洪涛△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.浙江省中医药研究院 浙江省立同德医院，浙江 杭州 310012)

脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)[1]指脑组织在血供中断的情况下，经溶栓等治疗手段及时恢复再灌注后，其组织损伤和功能障碍反而加重，甚至导致不可逆性的损伤。一般根据损伤区残存的血流量将其分为中心梗死区和半暗带区，中心区的神经细胞死亡形式主要以细胞坏死为主，而半暗带区的神经细胞死亡多表现为细胞凋亡和自噬性死亡。因半暗带区的神经细胞仍存在一定的代谢活力，故拮抗该区神经细胞的凋亡以及自噬性死亡是减轻脑缺血再灌注损伤的病理关键。而目前越来越多的研究表明[2-4]，内质网应激常常诱导CIRI后半暗带区的神经细胞凋亡和自噬性死亡，是脑缺血再灌注引起神经损伤的重要环节，因此，调控脑缺血再灌注后神经细胞的内质网应激，有望成为防治CIRI的新策略。

中医学的针刺疗法治疗缺血性脑卒中历史悠久，现以其稳定的疗效、治疗的整体性、治疗靶点的多样化以及毒副作用小和成本低等优势，得到了国内外医学界的广泛认可，其治疗的作用机理也得到逐步的阐释。有研究表明[5]，针刺对CIRI后诱导的内质网应激反应及细胞自噬均有良性的调节作用。本研究搜集国内外近10年来关于针刺对CIRI诱导ERS的影响的文献进行综述，以期为临床应用针刺防治缺血性卒中提供一定的科学依据。

1 内质网应激概述

内质网是负责生物合成和信号传递的精密细胞器，对维护内环境的稳定及决定细胞生存具有重要意义。内质网对内外环境的变化如缺血缺氧、毒素、能量供应障碍等具有非常高的敏感特性，当受到诸如此类的压力刺激时，内质网结构破坏，功能失衡，蛋白质折叠受阻，大量未折叠或错误折叠的蛋白质蓄积其中，诱发内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)[6]，并进一步激活内质网应激反应或未折叠蛋白反应(Unfold protein response, UPR)。适度的UPR可通过增加内质网相关性蛋白降解途径(ERAD)，促进内质网对堆积在网腔内的错误折叠或未折叠蛋白质的处理，以维持内质网的稳态平衡，保障细胞存活。而持久剧烈的UPR会进一步激活细胞的程序性死亡途径，诱发细胞自噬和细胞凋亡。

2 脑缺血再灌注损伤诱发内质网应激

脑缺血再灌注期间组织内无氧代谢增强，ATP释放水平迅速降低，无法维持神经元能量的供应，导致ATP依赖的离子转运机制失调，Ca2+不能正常的跨膜运转，加之内质网内钙离子的进一步释放，引发Ca2+超载，破坏内质网相关通道及其功能，导致内质网中的蛋白质二硫键形成减少，蛋白质折叠出现错误，诱发ERS[7]。而过度的ERS又进一步加重细胞内钙平衡的紊乱，二者在CIRI损伤的病理过程中互相促进、互为因果。同时脑组织缺血再灌注后，白细胞在缺血组织中大量浸润，清除坏死组织细胞产生的大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，而ROS是诱发内质网应激反应的又一条件，通过内质网应激途径引起细胞自噬与凋亡[8]。因此，通过抑制过强的内质网应激、减轻内质网负荷、促进内质网功能恢复，进而减弱神经细胞自噬和凋亡是减轻CIRI的重要机制之一。

3 针刺调控CIRI后内质网应激的研究概况

目前大量的实验研究表明[5-9]，针刺对大鼠脑缺血再灌注后诱导的内质网应激反应以及过度的内质网应激后引发的神经细胞自噬和神经细胞凋亡均有一定的影响。

3.1 针刺对内质网应激反应诱导的促细胞生存通路具有调节作用

UPR发挥调控作用涉及到诸多酶和转录因子，目前研究较多的有3种内质网跨膜受体[10]：蛋白激酶R样内质网激酶(Protein kinase R-like ER kinase，PERK) 、抑制物阻抗性激酶1(Inositol requiring enzyme 1，IRE-1) 和活性转录因子6( Activating transcription factor 6，ATF6) 。葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein78/Binding immuno-globulin protein，GRP78/Bip)是一种钙离子结合分子伴侣，主要位于内质网中，对维持内质网稳态和细胞正常活性具有重要作用。正常生理状况下，GRP78与PERK、IRE-1、ATF6这三种跨膜受体紧密结合，处于无活性状态。当ERS发生时，GRP78分别与之解离，转而与未折叠或错误折叠蛋白结合，减轻内质网压力。游离的PERK及IRE1通过自身磷酸化和二聚化被激活，ATF6经蛋白酶S1P和S2P在高尔基体内剪切后被激活，随后分别激活各自的下游信号通路进行调控。

目前，多数学者将GRP78蛋白的上调，作为ERS启动的标志因子[11]。脑缺血时，由于缺血缺氧等压力刺激导致ER内环境发生改变，蛋白质折叠受到干扰，出现错误折叠蛋白及未折叠蛋白的蓄积，随即诱导GRP78表达上调，进而与异常折叠蛋白进行有机结合，减少了错误折叠蛋白的数量，缓解了内质网的压力负荷，发挥了促细胞存活的作用[12]。较多研究显示[13-14]，在ERS状态下，针刺可通过上调GRP78蛋白的表达，减少内质网中异常折叠蛋白数量，从而发挥其神经细胞的保护作用。陈怀龙等[15]对脑缺血再灌注损伤的大鼠采用针刺大椎、百会穴预处理后，检测到GRP78的表达进一步上调，通过光镜下观察到缺血再灌注大鼠海马CA1区神经元异常形态数量的降低，提示上调GRP78的表达、抑制内质网应激可能是电针预处理脑保护作用的重要机制之一。J Shen等[16]同样发现电针内关、百会穴可以通过激活ERS、上调GRP78的表达，保护脑缺血再灌注损伤大鼠的缺血半暗带区的神经细胞。

3.2 针刺对内质网应激参与介导的细胞凋亡有抑制作用

在ERS中细胞凋亡程序的启动与C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12( Caspase-12)及c-Jun 氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK) 信号通路有关[17]。CHOP是内质网应激诱发凋亡的标志性基因[18]。PERK、ATF6以及IRE-1都能诱导CHOP的转录[19]。其中PERK-eIF2α-ATF4是CHOP蛋白表达主要途径。当内质网应激持续剧烈存在时PERK进一步被激活，促进ATF4翻译，诱导CHOP表达，破坏GRP78的保护作用而诱导神经元凋亡。Caspase-12是位于内质网中促进凋亡的第2条信号通路，是内质网应激诱导细胞凋亡的固有蛋白，能够单独通过内质网应激介导的凋亡途径诱导细胞凋亡。ERS未发生时，Caspase-12与Caspase-7和GRP78结合形成复合物，凋亡途径未被激活；ERS发生时，GRP78表达降低，Caspase-12不能与其充分结合，则Caspase-12被激活，进而促进细胞质中的Caspase-9被激活，通过Caspase的级联反应，将激活信号传递给Caspase-3，最终引起细胞凋亡。内质网应激中活化的JNK信号通路在应激反应和细胞死亡过程中扮演着重要角色，被认为是除CHOP与Caspase-12之外的另一条促凋亡通路[20]。活化的IRE1和肿瘤坏死因子受体-相关因子2(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2)结合，激活凋亡信号调节酶1(Apoptosis signal-regulating kinase-1，ASK1)，最终激活JNK通路，活化Caspase-12引起细胞凋亡[21]。张亚敏[22]采用电针百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠模型进行干预，证实电针可通过上调抑制凋亡基因Bcl-2的释放，下调CHOP、Caspase12 mRNA及凋亡基因Bax的表达，改善内质网应激，为临床针灸应用于缺血性脑血管病治疗提供了实验依据。宋洋[23]对MCAO大鼠局灶性脑缺血模型电针百会、内关穴治疗后发现大鼠神经功能障碍有所改善，行为学评分呈降低趋势。结果证明针刺可通过下调大鼠脑缺血再灌注后内质网应激通路PERK、eIF2α、ATF4基因表达，抑制神经细胞凋亡，继而减轻脑缺血再灌注损伤，其作用与依达拉奉相当。李文慧[24]通过手术制造脑缺血再灌注损伤大鼠模型，发现手术造模组大鼠CHOPmRNA表达明显升高，说明内质网功能出现异常。在百会、内关穴进行针刺干预后，CHOPmRNA表达显著降低，最终表现为神经功能缺损评分显著下降，脑梗死体积百分比有所减小。其他研究学者[25-27]发现,针刺可有效抑制脑缺血神经元细胞凋亡，其机制可能与上调内质网应激保护性GRP78表达及抑制促凋亡Caspase-12表达有关。

3.3 针刺对内质网应激诱导的细胞自噬具有良性的调节作用

ERS诱导的细胞死亡除细胞凋亡之外，还包括另一种程序性细胞死亡方式，即自噬性细胞死亡(autophagic cell death, ACD)。在脑缺血损伤中，自噬具有双面性[28]，自噬早期能有效清除细胞内受损的内质网，消除UPR和降解蛋白聚集体，有助于内质网中蛋白的正确折叠，维持细胞内环境平衡[29]。而过度的自噬可引起自噬性细胞死亡，加重神经细胞损伤[30]。Beclin1和LC3在哺乳动物细胞自噬过程中起着关键的作用。Beclin1 主要通过与Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶形成复合物参与自噬体的形成，其可介导其他自噬蛋白定位于自噬泡，从而调控自噬体的形成与成熟[31]，是自噬启动的标志[32]。ERS可通过PERK-eIF2α-ATF4通路激活自噬相关基因12(Atg12)，使微管相关蛋白轻链3-I(LC3-I)转化为LC3-II，诱发细胞自噬[33]。其中LC3-Ⅱ被看作是监测自噬活性的特异性标志物[34]，因此细胞内LC3-Ⅱ的表达变化可作为检测自噬状态的参考因子，Beclin1和 LC3-Ⅱ的大量表达可促进自噬发生[35]。有报道[36-38]认为,自噬可能是针刺减轻神经损伤、改善神经功能的机制之一。徐勤红等[39]采用“调神通督针法”治疗急性脑梗死疗效肯定，分析其作用机制可能是通过增加自噬量LC3-Ⅱ和Beclin1发挥了神经保护作用。舒适[5]通过实验证实，电针水沟穴对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的恢复具有明确疗效，其机制从上调ERS促生存细胞途径、减弱CHOP的表达以及抑制自噬表达水平共同发挥作用。冯晓东等[40]在脑缺血再灌注模型大鼠给予电针刺激后监测到脑组织中的Beclin-1表达上调，提出电针可通过提高自噬系统的表达水平而促进脑缺血再灌注损伤后大鼠的认知功能的恢复。

4 小结

综上所述，ERS在CIRI损伤的病理进程中发挥关键作用，一方面可激活UPR，促进内质网对错误折叠或未折叠蛋白的处理，保护神经细胞；另一方面又与CIRI后神经细胞的自噬、凋亡等现象密切相关。因此，对CIRI后神经细胞ERS及其调节机制展开研究，具有重要的理论价值和现实意义。针刺对CIRI后ERS及其诱导的神经细胞自噬、细胞凋亡的研究尚处于起步阶段，许多研究仅是针对内质网应激相关的促生存蛋白分子和ERS导致凋亡或自噬的某单一通路展开研究，且缺乏特异性的抑制剂、慢病毒干扰以及相关基因敲除等现代科技手段作对照，同时大多研究也忽略了假针刺及非穴位组的设立，在实验设计上尚缺乏严谨性与科学性。但相信随着现代科研技术手段的不断进步，随着针刺调控CIRI后ERS、细胞自噬与凋亡的严谨规范和更加细微深入的研究，针刺对CIRI后ERS、自噬与凋亡的调控机制会更加科学化、明确化，从而为缺血性脑卒中及脑缺血再灌注损伤的防治取得突破性的进展奠定坚实的基础。