病毒样颗粒作为口蹄疫病毒抗原表位载体的研究进展

李 茜，代军飞，王 俊，丁耀忠，马 炳，刘永生，张永光，张 杰

(中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室/国家口蹄疫参考实验室,甘肃 兰州 730046)

1 病毒样颗粒简介

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是由一种或多种病毒蛋白组装形成的无病毒核酸的空心颗粒。VLPs具有与病毒粒子相似的外部结构和抗原性，能携带外源蛋白，是构建多价疫苗的理想载体[1]。1978年，Brady和Consigli发现多瘤病毒的主要衣壳蛋白能自我组装成VLPs[2]。1984年，《Nature》杂志刊登了乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)VLPs疫苗的试验结果，当接种人血清源的同源或异源亚型adr和ayw病毒时，疫苗接种的黑猩猩完全受到保护[3]。1986年，HBs Ag-VLP疫苗被批准用于预防人HBV感染[4]。GSK公司生产的Engerix和Merck公司生产的Recombivax HB成为了世界上第一批VLPs疫苗[5]。随着研究的深入，研究者们发现了多种病毒的衣壳蛋白都能够自我组装成VLPs[6]。

VLPs是制备病毒疫苗较为理想的重组蛋白抗原，它具备以下优点:(1)不含病毒核酸；(2)与病毒颗粒相近的免疫原性；(3)可经MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子提呈，激动CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞；(4)能激活B细胞产生高滴度的抗体；(5)本身具有佐剂功能；(6)具有良好的生物相容性，可以作为载体呈现其他抗原[6]。

2 口蹄疫病毒的概述

口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，可引起猪、牛、羊及其他偶蹄类动物的急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的自然疫源性疾病口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)[7]。口蹄疫可以造成巨大的社会影响和经济损失[8]，是世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health,OIE)法定向其报告的动物传染病之一。

FMDV有7个血清型，每个血清型都易发生抗原变异，不能形成交叉免疫保护[9]。FMDV核酸为单股正链RNA[10]，其基因总长为8300个核苷酸，仅编码一条多肽链，其在蛋白酶的作用下裂解产生4种不同的结构蛋白(VP4、VP3、VP2和VP1)和一些非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)[11]。其中，结构蛋白VP1的G-H环(G-H loop)含有口蹄疫病毒最重要的抗原位点和识别整合素受体的RGD基序，其周围是高度可变区，可以作为外源抗原表位的插入或者替换位点。目前，防治口蹄疫主要是预防接种疫苗，但是传统的灭活苗或弱毒苗有散毒和突变的危险，疫苗的免疫效果还与运输、保存条件等相关。所以研制安全、低成本、易保存的新型FMD疫苗迫在眉睫。

3 FMDV抗原表位的预测

反向遗传学的兴起为研制新型FMDV疫苗提供了理论支持，它利用现代生物技术和分子病原学，通过分析病毒的基因组序列来预测其所有抗原信息，筛选出合适的抗原用于制备疫苗。这种方法与传统制备疫苗的方法完全不同，将其称为反向疫苗学[12]。

云涛等[12]利用计算机技术和分子生物学软件对口蹄疫病毒OLZ02株采用Garnier-Robson法[13]、Chou-Fasman法[14]预测其结构蛋白α螺旋、β折叠、转角和无规卷曲；用Karplus-Schulz法[15]预测了结构蛋白的柔软区域；用Kyte-Doolittle法[16]分析了其各结构蛋白的亲水性；用Emini法[17]预测了各结构蛋白的表面可能性；用Jameson-Wolf法[18]预测了各蛋白的抗原指数。众所周知，α螺旋、β折叠用于维持蛋白质的二级结构，不适合作为抗原表位。柔软区域、转角和无规卷曲比较疏松，容易与抗体结合。因此，综合评价FMDV结构蛋白的抗原表位，表明VP1蛋白含有的B细胞优势抗原表位最多，是研制口蹄疫新型疫苗的首选免疫原。

4 FMDV衣壳蛋白的体外组装

虽然FMDV衣壳蛋白组装的具体过程目前仍不清楚，但体外组装试验证实被感染的细胞中形成了几种不同的中间体[7]。首先，VP0、VP1和VP3形成5 S原粒，5个原粒随后组成12 S五聚体，12个五聚体构成70 S的病毒衣壳，在RNA包入衣壳的过程中，VP0裂解成VP4和VP2。

Abrams等将P1-2A-3C基因序列置于噬菌体的T7启动子后构建重组体，在牛痘病毒表达系统中表达FMDV衣壳蛋白后，感染BSC 40细胞[19]。蔗糖密度梯度离心结果表明：样品的沉淀物中有70 S VLPs，电镜下观察到直径为30 nm的VLPs。使用单克隆抗体检测特定抗原表位表明形成的VLPs具有天然病毒粒子的活性。Mohana等构建了含有O型FMDVP1-2A-3C基因的重组杆状病毒，结构蛋白P1-2A和蛋白酶3C在昆虫细胞sf9中得到共表达，成功组装成VLPs[20]。Bhat等将O型FMDV的P1-2A基因和突变的3C基因嵌入到载体构建重组表达载体，经蓝白斑筛选后得到的重组杆粒转染sf9细胞，细胞毒传代后经SDS-PAGE检测到VP0、VP1和VP3蛋白，双抗夹心ELISA验证表达的抗原具有很好的抗原性，表达的蛋白并最终组装成直径约25 nm的VLPs[21]。Veerapen等构建重组体使FMDVP1-2A基因在本塞姆氏烟草中短暂表达，并没有3C蛋白酶，P1-2A多蛋白被有效地加工成其组分结构蛋白，随后组装成VLPs，每克鲜叶材料的VLPs产量为0.030 μg；使用部分纯化的VLPs在小鼠中测试免疫原性，结果显示有FMDV特异性抗体产生[22]。Michael等利用FMDV 3C(L127P)突变体，可显著增加重组FMDV衣壳蛋白的产量，并在哺乳动物细胞中产生了FMDV VLPs，用单剂量该VLPs作为疫苗可以保护实验动物牛在同源FMDV的攻击下免于感染[23]。Guo等利用SUMO表达系统将Asia I型FMDV的VP1、VP3和VP0与SUMO融合后在大肠杆菌中表达，切除SUMO基团后，3个结构蛋白组装成VLPs。使用此VLPs免疫豚鼠、猪和牛，能刺激动物机体产生特异性免疫应答，并检测到T细胞的增殖和细胞因子IFN-γ的分泌。另外，用同源FMDV攻击该VLPs免疫的动物，牛的50%保护剂量(PD50)高达6.34[24]。Xiao等在大肠杆菌中开发了一种共表达系统，通过单个质粒串联驱动FMDV衣壳蛋白(VP0、VP1和VP3)的表达，共表达的FMDV衣壳蛋白(VP0、VP1和VP3)通过10 L规模的发酵大规模生产，并且色谱纯化的衣壳蛋白在体外自动组装为VLP。用该VLPs接种的牛显示出高保护效力，PD50达到每剂11.75[25]。

5 嵌合FMDV抗原表位的VLPs研究进展

5.1 FMDV-VLPs作为FMDV抗原表位的载体

Dong等将FLAG标签插入FMDV结构蛋白VP1的GH-Loop可变区不影响VLPs的形成，说明外源肽段的插入不影响FMDV衣壳蛋白的空间结构，但插入肽段的大小会影响VLPs的组装效率[26]。将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒抗原表位插入O型口蹄疫病毒可变区，结果外源表位的插入没有影响型O型口蹄疫VLPs的空间结构，同时发现制备的嵌合VLPs能够被O型口蹄疫和亚洲Ⅰ型特定表位的抗体识别，说明可变区抗原表位的插入没有破坏型口蹄疫病毒可变区的免疫表位，还将亚洲I型口蹄疫病毒特定免疫表位呈递到病毒衣壳表面[24]。Liu等使用O型FMDV结构蛋白VP1和A型FMDV的VP2、VP3、VP4构建嵌合型VLPs。用该嵌合型VLPs接种的5只豚鼠中的4只完全免受FMDV毒株O/MAY98攻击[27]。Dong等将FMDV 3D基因的反义RNA包装入VLPs，ELISA和Western blot检测结果表明该表位RNA VLPs可以产生免疫反应。在小鼠和豚鼠中测试疫苗的效力，表明该表位RNA VLPs疫苗保护了40%的乳鼠和85%(17/20)的豚鼠。实验数据说明表位RNA VLPs疫苗将来在探索和开发针对FMDV的疫苗中具有一定的价值[28]。口蹄疫病毒(FMDV)的7种血清型中，O型占优势，但其病毒衣壳比其他血清型更敏感，使得在低pH值昆虫细胞中产生O型VLP更加困难。Li等开发了一种用于O型FMDV的新型基于VLPs的候选疫苗。该嵌合VLPs由来自血清O型的VP1和来自血清Asia I型的病毒衣壳蛋白的片段组成，它以类似于灭活疫苗的功效保护豚鼠免受FMDV攻击。这些结果均表明FMDV结构蛋白能形成VLPs，并具有产生针对相应血清型FMDV特异性反应的潜力[29]。

5.2 HBc-VLPs作为FMDV抗原表位的载体

乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)是HBV的核衣壳蛋白，HBc经大肠杆菌重组表达后可在体外自主包装成VLPs，并具有强烈的免疫原性。HBc-VLPs是由HBc单体组成的二十面体颗粒，有两种形态：由180个单体组成T=3型颗粒，直径约30 nm；由240个单体组成T=4型颗粒，直径约34 nm[30]，T代表二十面体一个面上划分成小型等边三角形数目[31]。在HBc-VLPs表面有刺突结构，称为免疫显性区(MIR)，该区域作为遗传操作的靶区域，可用计算机软件预测的FMDV抗原表位替换或插入，供B淋巴细胞识别，诱导针对插入抗原表位的特异性体液免疫应答[32]。

FMDV抗原表位与HBc-VLPs融合的方法有4种：与HBc的N-末端结合；与HBc的C末端结合；插入至HBc的MIR区；通过连接子(linker)将HBc整合为二聚体，第1个HBc的MIR区空置，第2个MIR区插入表位。N-末端结合多肽受到长度限制，不能超过50 aa；C末端插入位置选择在144、149、156位氨基酸，片段长度不能超过100 aa，否则会影响VLPs组装[33]；而MIR区域是常用的外源序列插入区域，可选择将外源肽插入至76～82 aa之间或完全替换MIR区域。HBc-VLPs既可以是胸腺依赖性抗原，又可以是非胸腺依赖性抗原[34]。作为胸腺依赖性抗原时，HBc所包含的Th细胞表位可被人体和小鼠识别，产生针对HBc和其包含外源抗原的免疫应答[35]。HBc可诱导Th细胞活化，并可产生对HBc和其携带FMDV抗原表位的适应性免疫应答，该特征使HBc成为理想的FMD疫苗载体[36]。

1987年，Clarke等[37]首次在《Nature》上发表使用HBc作为抗原表位载体，将FMDV VP1蛋白第141～160 aa表位多肽融合至HBc的N-末端，实验表明，该段多肽的免疫原性明显提高了。姜志刚将亚洲I、O型FMDV抗原表位插入在HBc的MIR区，利用真核细胞表达系统，形成嵌合型VLPs，其与相应的单抗有强的反应活性，说明抗原表位被成功地展示在HBc表面[38]。

5.3 PCV2-VLPs作为FMDV抗原表位的载体

猪圆环病毒2型(PCV2)是近年来新发现的引起猪繁殖障碍等多种疫病的一种重要病原。PCV2是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的无囊膜的单股环状DNA病毒，基因组全长约为1767 bp，病毒的衣壳蛋白含有一种衣壳蛋白ORF2，60分子的ORF2蛋白可自主组装产生二十面体对称的病毒衣壳结构[39]。

将FMDV VP1 G-H环与异源病毒衣壳蛋白融合形成病毒粒子嵌合体[40]，有助于扩展病毒的抗原谱，提高病毒的免疫原性，将G-H Loop上的线性表位与诱导更强细胞免疫的载体蛋白结合可以诱导免疫动物产生高比率中和抗体，说明强免疫原性的载体蛋白可以增强针对线性表位的抗体应答[41]。李艳丽在PCV2衣壳蛋白长loop环CD/EF/GH内嵌合FMDV G-H环，形成的VLPs有利于FMDV中和抗原表位的展示和中和抗体的产生[39]。曹轶梅等将FMDV结构蛋白VP1的抗原表位插入到PCV2衣壳蛋白的核定位信号序列中，在大肠杆菌中表达并获得嵌合型VLPs，实验结果表明，针对PCV2、FMDV均有良好的免疫反应，但是有一定的差异，说明PCV2衣壳蛋白的N-端不适合插入抗原表位递呈在表面[42]。张飞雁等将O型FMDV中和表位插入到PCV2的CAP蛋白的C-端，ELISA、电镜检测均表明其成功构建嵌合型VLPs，为研制基因工程疫苗奠定了基础[43]。

5.4 PPV-VLPs作为FMDV抗原表位的载体

猪细小病毒(PPV)是细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parvovirus)的成员。PPV的主要结构蛋白VP2在体外表达系统中能够组装成VLPs，在VP2蛋白N端连接外源细胞抗原表位能装配成病毒样颗粒，而且能检测到针对该嵌入抗原的免疫应答，这些实验说明PPV-VLPs可以作为外来抗原的载体，以此构建出良好免疫原性和安全性的重组多价基因工程疫苗[44]。

Dalsqaard等在对犬细小病毒4个loop的插入研究中发现，loop2插入的重组体不仅能表达出最多的病毒样颗粒，而且是唯一能引起免疫应答和中和反应的重组体[45]。潘群兴等将O型FMDV上的抗原表位插入到PPV VP2蛋白不同Loop区，利用昆虫杆状病毒表达系统获得VLPs，Western Blotting检测在有64 kDa大小有特异性条带，电镜观察其组装成了VLPs[46]。李文丽成功构建了嵌合口蹄疫病毒抗原表位的PPV-VLPs，并利用昆虫杆状病毒表达系统获得了重组蛋白，用其免疫豚鼠获得了低水平的FMDV抗体[47]。范朋举将FMDV抗原表位插入了PPV-VP2蛋白表面的5个不同位点，寻找VP2蛋白上潜在的VLPs组装非必需区，结果显示在Loop1和C-端插入FMDV抗原表位后没有形成VLPs，形成的VLPs使用ELISA检测获得了较高的抗体效价[1]。

6 影响VLPs展示FMDV抗原表位的因素

6.1 表达系统的选择

目前，FMDV衣壳蛋白已成功在原核表达系统(大肠杆菌)、昆虫细胞表达系统(杆状病毒)和多种哺乳动物细胞表达系统(牛痘病毒、腺病毒)中重组表达并组装成VLPs[7]。哺乳动物细胞表达系统与其他表达系统不同，其所指导的转录发生在胞浆中。牛痘病毒作为载体，能携带较大的外源DNA片段，进行翻译后加工处理，指导蛋白质形成正确的空间结构，运输和分泌表达的蛋白，但它表达重组蛋白的效率较低[19]。人腺病毒5型(Ad5)作为载体也应用广泛，该病毒去除E1区缺少复制能力，可以减少野生毒株的负面影响；去除E3区可以增加病毒作为载体的携带量，主要的优点是不与细胞基因组发生整合，可以感染处于不同时期的细胞，但是其作为载体还需要提升其蛋白表达量和延长表达时间[48-50]。昆虫细胞表达系统能通过特定酶切位点将多个基因片段同时嵌入载体，获得的重组杆粒能表达出异源性的多蛋白复合物，并可对多蛋白复合物进行翻译后加工修饰，但其表达蛋白的时间较长，费用昂贵[51]。原核表达系统研究比较完善，其遗传稳定、繁殖周期短，目的蛋白表达水平和稳定性高，但缺乏对蛋白质的翻译后加工及复性，形成不溶性蛋白[24]。为使目的蛋白可溶性表达，研究者们采用SUMO表达系统及标签蛋白纯化技术，设计带有标签的SUMO蛋白与目的蛋白融合。融合蛋白在大肠杆菌体内可溶性表达后，SUMO蛋白酶特异性识别并切除带有标签的SUMO蛋白，可以还原目的蛋白天然构象[26]。

6.2 体外组装缓冲体系

选择表达FMDV抗原表位的载体不同，体外组装成VLPs的条件也会发生变化。有报道显示，O型FMDV衣壳比其他血清型对酸更敏感，并且难以在低pH值的昆虫细胞中组装[52]。衣壳蛋白体外组装倾向于疏水作用和共价键结合，高盐和高温条件都会使溶液疏水作用增强，但衣壳蛋白体外组装是一个缓慢过程，高温容易使蛋白降解不利于VLPs组装[26]。溶液酸碱度影响蛋白质分子表面电荷状态，改变蛋白质分子间及蛋白质分子与溶液中的粒子之间相互作用力。依据衣壳蛋白等电点和溶液中的粒子强度调节溶液pH值，使衣壳蛋白以天然结构存在并通过共价键或疏水作用有规则缓慢聚集成VLPs，中性偏碱或者碱性条件下FMDV-VLPs都能组装[26]。总体来说，在pH值、温度、缓冲体系离子强度的综合影响下，才能使VLPs正确组装。

6.3 FMDV抗原表位的插入位点和大小

对FMDV结构蛋白的研究发现，G H loop突出于病毒衣壳表面，包含FMDV的主要抗原表位。研究表明，loop环中保守的RGD序列与FMDV侵入宿主细胞密切相关，且RGD序列两侧的残基高度可变，可以作为外源肽段的插入位点。FMDV抗原表位可以与HBc的N-末端结合，与HBc的C-末端结合或插入(置换)到HBc的MIR区[53]。FMDV抗原表位可以插入PCV2衣壳蛋白长loop环CD/EF/GH内形成嵌合VLPs[28]。PPV结构蛋白VP2 loop2中插入FMDV抗原表位能表达出嵌合VLPs[33]。不同的插入位点会影响FMDV抗原表位在VLPs的展示，进而影响其免疫原性。而加入的FMDV抗原表位的大小可能会导致组装效率改变，有可能还会影响VLPs的空间构型，导致其不能正确组装。研究表明，用完整VP1结构蛋白组装成的嵌合VLPs比单独的VP1中和表位抗原性高许多，它能展示VP1上的所有优势抗原表位，空间构象正确且B细胞表位完全暴露，组装成的VLPs有可能正确呈现优势B细胞表位三级结构，这样就可能拥有与FMDV天然病毒粒子相近的免疫效果[12]。

7 讨论

口蹄疫在数百年的流行中，不仅给世界各国带来了巨大的经济损失，而且其间接损失是无法估量的。自从发现口蹄疫病毒粒子以后，抗口蹄疫的研究未曾停止，但是口蹄疫病原变异性极强，7个血清型之间没有交叉免疫，同型内不同病毒株的抗原性也不同，新毒株的不断出现，使疫情不断出现高潮，这使得口蹄疫难以得到有效的防治。传统的疫苗为弱毒疫苗和灭活苗，这些疫苗存在散毒和变异的危险。随着反向遗传学的兴起，新型疫苗的研制大步向前，有效解决了散毒和变异的危险，为制备联苗和多价苗奠定了基础。

VLPs不含病毒核酸，是制备病毒疫苗较为理想的载体，能够将外源多肽表位展示在表面，用VLPs制备FMD的亚单位疫苗具有广阔的研究前景。目前研究较多的几种VLPs，如FMDV-VLPs、HBc-VLPs、PCV2-VLPs和PPV-VLPs都成功作为载体将FMDV抗原表位展示在表面，并获得了针对FMDV的保护力，VLPs既可以与其他危害严重的疾病一起制备为多价苗，也可以与同血清型病毒一起制备联苗。但是常用的几种表达系统组装VLPs的效率低，形成VLPs的各个基因表达量不易控制，所以VLPs作为FMDV抗原表位载体的疫苗研制还需要更多的探索。