皮肤结核病研究进展

陈燕清 王洪生

中国医学科学院北京协和医学院皮肤病医院分枝杆菌实验室，南京 210042

结核病是传染病中的“头号杀手”。2016年全球仍有约1 040万新发结核病例，其中我国新发病例89.5万，排名第3［1］。皮肤结核占肺外结核病例的1%～2%［2-3］，但由于漏诊误诊较多、缺乏病例上报系统，实际发生率可能更高。为了提高皮肤科医师对该病的认识，我们对皮肤结核的病因、临床表现、实验室检查和治疗进展等进行综述分析。

一、病因与发病机制

皮肤结核是结核分枝杆菌复合群引起的感染性皮肤病。结核杆菌复合群包括人型结核杆菌（M.tuberculosis）、牛型结核分枝杆菌（M.bovis）、卡介苗，牛型结核分枝杆菌的减毒株（M.bovisBCG）、非洲型分枝杆菌（M.africanum）、田鼠分枝杆菌（M.microti）、卡氏分枝杆菌（M.canettii）、M.pinnipedii、M.caprae和M.mungi。皮肤结核大多由人型结核杆菌感染引起，偶尔由牛型结核分枝杆菌、卡介苗引起［4］。最近分子流行病学分析发现，我国皮肤结核菌株基因分型与肺结核菌株大多数同属于北京型，而在一些多位点数目可变串联重复序列分析（mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat typing，MIRUVNTR）位点如MIRU20、ETRC等与肺结核菌株有差异，尤其是皮肤结核菌株耐药的发生率明显少于肺结核菌株［5］。

结核杆菌侵入人体皮肤有不同的途径。首先是外源性接种，结核杆菌经由未曾感染过结核杆菌的宿主的皮肤损伤部位初次接种可引起原发性皮肤结核，而在曾感染过结核杆菌、存在较强免疫应答的患者中再次接种结核杆菌可导致疣状皮肤结核或寻常狼疮［4］。其次是内源性感染，常来自于邻近感染病灶的扩散，如淋巴结结核、骨结核的扩散引起的瘰疠性皮肤结核，也可由肺部、肠道、泌尿道感染的结核杆菌在排出过程中接种至腔口部位皮肤黏膜引起。此外，结核感染还可以通过淋巴、血液循环播散，因宿主免疫不同有不同的临床表现，包括播散性粟粒性皮肤结核、寻常狼疮、结核性树胶肿、转移性结核脓肿等［4］。在对结核杆菌有较强免疫反应的患者，宿主对结核杆菌抗原成分的超敏反应可引起不同的皮损，该组皮肤损害统称为结核疹。结核疹患者结核菌素皮肤实验或结核感染T细胞检测（T-SPOT.TB）阳性，组织病理呈肉芽肿性炎症改变，皮损处分枝杆菌培养阴性，系统抗结核治疗有效，部分患者通过PCR技术可检测到结核杆菌DNA［2，6-7］。

二、临床表现

皮肤结核临床表现多样，典型皮肤结核包括寻常狼疮、瘰疠性皮肤结核、疣状皮肤结核、腔口部皮肤结核。结核疹最常见的3种类型是硬红斑、丘疹坏死性结核疹和瘰疠性苔藓［4，8-9］。一项多中心回顾性研究发现，我国皮肤结核和结核疹患者中硬红斑最常见，其次依次为寻常狼疮、疣状皮肤结核、丘疹坏死性结核疹、瘰疬性皮肤结核等［10］。合并其他脏器结核的皮肤结核在我国约占所有皮肤结核病例的1/3，在国外儿童皮肤结核患者中的比例较成人患者高，为12.7%～53.4%［11-12］。

三、病理学检查

各种类型皮肤结核的病理检查均可见上皮样细胞肉芽肿，可伴或不伴特征性干酪样坏死和抗酸杆菌，与宿主的免疫反应不同有关。急性期还可见中性粒细胞浸润。需要与结节病、其他分枝杆菌感染、真菌感染、寄生虫感染、异物反应等肉芽肿性疾病鉴别。此外需注意皮肤结核也可以出现其他病理模式，如结节病样肉芽肿、栅栏状肉芽肿、非特异性慢性炎症和脂膜炎等。结核疹中，瘰疠性苔藓可见真皮浅层或毛囊周围的结核样结节，而丘疹坏死性结核疹较常见的为血管炎性改变，硬红斑常呈小叶性脂膜炎模式［8，13］。

四、实验室检查

病原学检测是确诊重要的依据，但皮肤结核皮损中菌量通常较少，且细菌分布不均，增加了实验室病原学检查的难度。目前，皮肤结核的诊断技术在传统的实验室检查方法的基础上，结合免疫学、分子生物学等已取得较大进展。

1.染色涂片镜检：对感染部位的组织液、引流液等进行抗酸染色，光镜下观察，若看到抗酸杆菌［14］，高度提示结核感染可能，但该方法敏感度低，不能区分结核杆菌与非结核分枝杆菌［15］。2012年世界卫生组织推荐引入荧光染色镜检（light-emitting diode fluorescence microscopy），该方法敏感度提高，操作便捷，但特异度低，缺乏质控过程，技术要求高等，限制了其广泛应用［16］。

2.结核菌培养：传统的固体培养基主要为Lowenstein-Jensen培养基（罗氏培养基）和Middlebrook 7H10培养基。不同实验室的敏感度差异较大。结核菌在固体培养基上生长缓慢，需要4～12周［17］。应用“改良罗氏培养基”［18］可获得较高的敏感性。

基于液体培养基的方法目前已有应用。结合改良Middlebrook7H9肉汤和荧光检测技术的半自动培养系统BACTEC MGIT 960，是依赖一种氧敏感荧光化合物检测分枝杆菌的生长：当接种分枝杆菌后，分枝杆菌生长消耗氧，即产生荧光反应，产生橙色的荧光。该方法平均培养时间约为固体培养基的1/3，且相对固体培养基敏感度更高，利于后续的药敏实验［17-19］。

3.生化鉴定：通过分析分枝杆菌的形态、生长速度、色素形成、生长温度及耐热触酶实验和硝酸盐还原实验结果等可对分枝杆菌的群、种做初步鉴定，即“生化鉴定”。然而分枝杆菌各类种群的特性多有交叉或细微的改变，因此生化鉴定准确性受限，目前临床应用少。

4.免疫学检测：结核菌素皮肤实验通过测量结核菌素注射部位硬结的大小，评估机体对结核菌素抗原的迟发型超敏反应，从而判断结核感染状态。该方法价格低廉，但结果判读主观性强，且受卡介苗接种、环境中多种非结核分枝杆菌的干扰，特异度较差；另外，其在免疫抑制人群中的敏感度较低［15］。

干扰素γ释放实验通过检测外周血对早期分泌靶向抗原（ESAT-6，相对分子质量6 000）和培养滤过蛋白（CFP-10，相对分子质量10 000）肽库的反应，辅助检测结核感染。由于ESAT-6与CFP-10的编码基因区在卡介苗和大部分非结核分枝杆菌中缺失，因此其特异度较高［20］。目前用于临床的有QuantiFERON-TB Gold In-Tube实验和T-SPOT.TB实验。T-SPOT.TB实验在皮肤结核的诊断中敏感度较高，但与海鱼分枝杆菌、戈尔登分枝杆菌等皮肤感染有交叉阳性，需要进一步鉴别［21-22］。

在结核菌素皮肤实验基础上改良设计的C-tb实验利用ESAT-6和CFP-10的重组体进行皮内注射，结合了结核菌素皮肤实验的可操作性和干扰素γ释放实验高特异度的优点，目前仍在临床试验阶段［23］，有望将来应用于皮肤结核诊断和监测中。此外，研究发现重组多聚蛋白PstS1-LEP有潜力用于肺外结核的血清学检测［24］。

5.PCR检测：PCR检测敏感度、准确度高，耗时短，是协助皮肤结核诊断的有力工具。目前用于检测结核杆菌复合群的特异性靶DNA序列包括IS6110插入序列、hsp65编码序列（Rv0440）、16S rRNA序列、85B蛋白编码序列、MPB-64/MPT-64蛋白编码序列（Rv1980c）、38 000蛋白编码序列（Rv0934）、TRC4（保守重复序列）、GCRS（富GC重复序列）、hupB（Rv2986c）、dnaJ（Rv0352）、MTP-40蛋白编码序列（Rv2351c）和PPE基因（Rv0355）等［25］。

IS6110序列在结核分枝杆菌复合群中以多拷贝形式存在，其应用使PCR检测敏感度升高，但有报道部分地区临床菌株的IS6110序列拷贝数少，可导致假阴性结果［26-27］。分枝杆菌中16S rRNA、hsp65、rpoB、16S-23SrRNA间隔区序列有种内多态、种间保守的特征，PCR扩增后进行酶切或测序对鉴别菌种有重要价值［27］。其中，16S rRNA鉴别能力较低，但相关数据库最完整，对于少见的非结核分枝杆菌的鉴别意义较大；hsp65、rpoB、间隔区序列有更大的核苷酸多态性，有种、亚种特异性的等位基因存在，因此鉴别能力相对较强［28］。

与普通PCR相比，巢式PCR和多重PCR的引入提高了检测的敏感度，目前在菌量少的皮肤结核中显示出良好的应用价值，并能鉴别结核分枝杆菌复合群内的分枝杆菌［29-31］。此外，环介导等温扩增法（LAMP）有简单、快速、耐受PCR抑制剂的特点，其敏感度高于巢式PCR和多重PCR，而且其对设备要求低，LAMP有望成为取代PCR的检测方法［32-34］。

近年新开发的The Xpert MTB/RIF实验（Xpert实验）是一种商品化的快速、自动化的分子检测实验，以结核杆菌rpoB基因序列为靶序列，通过半巢式实时PCR和分子信标技术检测结核杆菌和利福平耐药［35］。该方法能有效降低感染性气溶胶形成、扩增污染菌的机会及人为操作误差，且不需要配备多个实验室操作间［35］。目前，Xpert实验已被WHO许可用于肺结核的检测，但对肺外结核不同的样本类型诊断价值不一，且在皮肤结核中的应用价值仍未证实［36］。

6.药敏实验与耐药检测：结核菌耐药是结核病持续存在至今的原因之一。目前3.6%的新发结核病例和高达20%的继发性结核病例已出现多重耐药［1］。近年我国皮肤结核菌株耐药基因筛查发现，分离自皮肤结核皮损中的结核菌株耐药率较低［5］。

传统的耐药检测方法包括比例法（proportion method）、临界药物浓度法（critical concentration method）和抗性比例法（resistance ratio method），都是基于检测结核分枝杆菌在含已知浓度的药物的培养基中生长的能力。这些方法准确可靠，但均步骤复杂，耗时很长，至少需要3周培养时间［36-37］。基于液体培养基的药敏实验，结合放射定量的方法可有效检测菌株对药物的敏感度，且缩短了检测时间［38-39］。BCTEC MGIT960系统就是基于液体培养基的一个商品化、自动化的系统，目前是WHO推荐的耐药检测方法。此外，一些非商品化的方法，如比色氧化还原指示剂法、硝酸盐缩小实验、显微镜观察药敏法等也被WHO推荐用于评估结核菌多重耐药的风险［40-41］。

DNA测序技术的成熟和价格的显著降低使耐药基因检测越来越多地用于临床。目前研究陆续显示，利福平耐药与rpoB基因突变相关，吡嗪酰胺耐药主要是由于pncA基因突变导致，异烟肼耐药主要由katG、inhA和ahpC基因突变引起，链霉素耐药主要与rrs和rpsL基因突变相关，乙胺丁醇耐药主要是因为embB基因发生突变，克拉霉素耐药主要是由于23sRNA肽酰转移酶基因突变所致，喹诺酮类耐药主要是由gyrA基因突变引起［41-42］。上文提到的Xpert实验应用于rpoB基因检测评估利福平耐药，已显示出较好的价值，且可以2 h内获得结果［38］。

五、诊断与鉴别诊断

当出现慢性、非对称分布的皮损时，需怀疑皮肤结核。临床上一般需要与结节病、盘状红斑狼疮、淋巴瘤以及其他感染性肉芽肿性疾病如真菌感染、梅毒树胶肿等鉴别。硬红斑需要与结节性红斑、血管炎鉴别。丘疹坏死性结核疹需要和急性痘疮样苔藓样糠疹等鉴别。

皮肤结核的确诊缺乏统一标准，目前需要综合病史尤其是结核病史或接触史、皮损特征、组织病理检查、病原学检测结果等进行诊断。皮肤结核临床表现呈多样化改变及实验室检查开展较为局限是目前皮肤结核误诊、延迟诊断的常见因素。因此提高对皮肤结核皮损特征的认识和实验室检测技术水平，是提高皮肤结核正确诊断率的重要策略。此外，对分枝杆菌培养阳性、抗酸染色阳性的病例，还需要与非结核分枝杆菌感染鉴别，可借助分子生物学方法进行实验室诊断和鉴别诊断［9］。

六、治疗

WHO推荐的标准的结核病治疗方案包括2个月强化治疗和4个月维持治疗。强化治疗包括乙胺丁醇、异烟肼、利福平、吡嗪酰胺四联药物治疗，维持治疗为异烟肼和利福平二联药物治疗，如异烟肼可疑耐药，则维持阶段用吡嗪酰胺替代［2，43］。由于我国皮肤结核菌株对传统抗结核药物耐药发生率低［5］，因此一旦确诊皮肤结核便可及时给予上述标准抗结核治疗方案，绝大部分患者均能获得满意疗效。对于皮损泛发、合并骨结核等内脏结核和HIV阳性的患者，维持治疗时间需延长。药物不良反应导致治疗中断是影响疗效的常见原因。治疗期间，需注意予B族维生素预防异烟肼引起的周围神经病变，还需注意患者胃肠道、眼部、神经系统的不良反应，且需监测血常规、肝肾功能［43］。如对标准抗结核方案反应欠佳或皮损进行性加重的患者，需要根据药敏实验结果调整治疗方案。二线的抗结核药物有阿米卡星、卡那霉素、链霉素、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、加替沙星［9］。对于结核疹患者，需要查找内脏结核，加用抗结核药物如利福平［43］。

多重耐药结核的流行是目前全球结核病疫情控制的严峻挑战。对于多重耐药结核，莫西沙星和左氧氟沙星被认为是安全有效的替代药物，利奈唑胺（linezolid）可能对复发的多重耐药结核有效［44］。此外新的有效抗结核药物在不断研发中，迪拉马尼（delamanid）、贝达喹啉（bedaquiline）、PA-824已在进行III期临床试验，乙二胺同类物SQ-109和SQ-73正在进行Ⅱ期临床试验［44-45］。

七、总结

综上所述，近年来皮肤结核在实验室诊断技术、药敏实验和分子耐药技术方面取得较大进展，以分子诊断技术和自动化系统的应用较为突出。新的抗结核药的研究也正向前推进，但目前主要的问题是皮肤科医师对皮肤结核的临床表现、病因与发病机制的熟悉程度较低，实验室检测技术特别是现代化诊断技术在很多地区开展较少，造成较多的误诊、误治或延迟诊疗。未来，皮肤结核的流行病学研究有待加强，分子诊断技术、药物研发将持续快速发展，皮肤结核将进入精准诊断与治疗时代。