维生素D免疫调节的研究进展

张爱飞 冯正平

重庆医科大学附属第一医院内分泌科， 重庆 400016

维生素D的主要生理作用是调节矿物质稳态与骨代谢，研究逐步发现1α-羟化酶和VDR的表达超出了经典内分泌途径所涉及的组织，如免疫细胞和肿瘤细胞，提示维生素D具有诱导细胞分化、抑制细胞增殖、调节免疫系统和调控其他激素系统多效性作用。维生素D通过自分泌或旁分泌与维生素D受体结合，通过激活和调节多种细胞通路来调节其生物学效应，在许多疾病如内分泌疾病、慢性疾病和癌症进展中具有重要意义。

1 概述

1.1 维生素D的来源与转换

维生素D是一种脂溶性类固醇激素，主要形式包括来源于植物的维生素 D2(麦角骨化醇)和来源于动物的维生素 D3(胆骨化醇)[1]。人体内的维生素D仅少量来源于食物，主要由皮肤中的7-脱氢胆固醇经紫外线照射后生成。在肾脏和肝脏中，维生素D分别由25-羟化酶(CYP24A1、CYP2R1)、1α-羟化酶(CYP27B1) 两次羟化生成具有生物活性的1, 25二羟维生素D3[1,25(OH)2D3，又称骨化三醇][2]。在维生素D结合蛋白转运下，1,25(OH)2D3与靶器官的维生素 D 受体(VDR) 结合发挥生物学效应。

1.2 维生素D受体

维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)包括细胞核受体(nVDR)和细胞膜受体(mVDR)。1,25(OH)2D3作为配体在细胞核中结合 nVDR 和RXR形成一个复杂异源二聚体，1,25(OH)2D3-VDR-RXR 复合物特异性结合DNA 靶基因的启动子区域，进而调控靶基因的转录蛋白合成来发挥生物功能[3]。此外，维生素D也可以与mVDR结合产生非基因组效应[4]。近年来发现[5]树突状细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞中同样存在VDR，免疫细胞也能将25(OH)D3代谢为活性形式1,25(OH)2D3。因此，维生素D对机体有免疫和适应性免疫的调控作用[6]。

2 维生素D的免疫调节作用

免疫细胞由于表达1α-羟化酶和维生素D受体，能够合成维生素D的活性代谢物,提示了维生素D类似于细胞因子的免疫调节特性。不同于肾脏细胞，1α-羟化酶在巨噬细胞和树突细胞中不受甲状旁腺素、钙和1,25(OH)2D3调节,主要受干扰素(interferon,IFN)-γ和脂多糖影响[7]。近年来大量研究[6]证实维生素D无论是对固有免疫还是适应性免疫均起着重要作用。

2.1 维生素D对抗原提呈细胞的作用

抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)是可以处理抗原并以抗原肽-MHC分子复合物的形式将抗原提呈给T细胞的一类细胞。树突状细胞(dendritic cells，DCs)是功能最强的抗原提呈细胞。在脂多糖刺激下，维生素D通过抑制单核细胞来源的DCs的p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子-κB (NF-κB)信号途径[8]调控白细胞介素(interleukin,IL)的分泌，从而抑制 DCs 分泌促炎细胞因子 IL-12、IL-23,增加抗炎细胞因子IL-10和T细胞抑制分子(programmed death 1,PD-1) 的产生，生成具有免疫耐受的诱导与维持功能的 DCs[9]。此外，维生素D可抑制DCs的成熟、分化,从而下调共刺激分子CD40,CD80,CD86和主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子的表达。DCs是唯一能直接激活初始T细胞的专职性APC， DCs刺激信号是初始T细胞活化必不可少的条件，若维生素D阻碍DCs的成熟， 初始T细胞的激活因缺乏成熟 DCs所必需的表面分子，导致抗原特异性 T 细胞无反应。IL-12是 APC 分泌的重要细胞因子，具有促进TH1细胞增殖和分化作用，维生素D 能显著抑制DC IL-12的产生，从而减弱DCs提呈抗原和激活免疫应答的功能，导致T细胞数量下降，活性下调。维生素D对免疫系统的重要作用已有较多相关研究予以证实。Moredun等[10]的研究结果表明活性维生素D诱导牛单核细胞源树突状细胞(monocyte-derived dendritic cells,MoDCs)免疫耐受，减少IL-12、增加IL-10的分泌，抑制MoDCs刺激T细胞的能力，从而影响免疫应答。另一研究[11]表明给予健康人群补充高剂量(480 000 IU)的维生素D可降低肠固有层CD103+DCs的数量，诱导增加转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)以及IL - 10细胞因子mRNA的表达，上调PD1、PD-L1、CD80,、CD86共刺激分子mRNA的表达。T细胞免疫球蛋白及黏蛋白4(T cell immunogiobulin domain and mucin domain 4,TIM4)是Th2细胞分化的关键因子，近几年有研究[12]认为维生素D调控DCs中TIM4表达，抑制TIM4基因的转录和表达，进而影响T细胞的分化。成熟DCs表达溶酶体相关膜糖蛋白3(lysosomal associated membrane glycoprotein,LAMP3)，维生素D3在树突细胞分化和成熟过程中通过抑制NF-κB通路减少LAMP3基因转录和表达，从而阻碍DCs分化成熟，从而诱导耐受性DCs产生[13]。

2.2 维生素D对单核-巨噬细胞的作用

单核-巨噬细胞在固有免疫应答中起着重要作用，维生素D可以促进单核细胞向巨噬细胞分化，巨噬细胞在干扰素-γ刺激下可以在胞内合成 1,25(OH)2D3，1,25(OH)2D3作为配体与nVDR 结合发挥作用。维生素D在单核-巨噬细胞中通过自分泌途径刺激TLR2/1、TLR4以及干扰素-γ或CD40受体[14]，被激活的受体启动相关信号级联反应，诱导VDR和CYP27B1表达的上调，导致25(OH)D到1,25(OH)2D3的转换。1,25(OH)2D3与单核-巨噬细胞VDR结合致使抗菌肽、β-防御素4以及参与自噬和吞噬等多目标基因表达[15]，从而参与细胞内对病原体的破坏[16]。维生素D能够增加巨噬细胞吞噬能力和趋化能力，能够增强单核巨噬细胞对肿瘤细胞的趋向性和细胞毒性作用，抑制单核细胞的黏附活性。单核-巨噬细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)或抗原识别受体与病原体细胞共有特定表位分子的识别结合，产生非特异性免疫。Toll样受体(toll like receptor,TLRs)识别病原体相关的分子模式诱导免疫反应，维生素D可抑制单核细胞表面TLR2的表达，从而对病原体相关模式分子产生免疫应答不足的状态，致炎性细胞因子、肿瘤坏死因子-α产生减少，防止 TLRs过度活化和在感染后阶段的炎症发生，是一种负反馈调节机制。高迁移率族蛋白1 (HMGB1)是内毒素致死效应的晚期重要炎症介质，TLR2和TLR4可与巨噬细胞分泌的HMGB1结合，促使NF-κB活化，诱导炎症发生。在巨噬细胞中，维生素D可能通过激活核转录因子E2相关因子 2(Nrf2)/血红素加氧酶(HO)-1途径通路，降低内毒素诱导的 HMGB1分泌,阻断HMBG1核易位，从而抑制脓毒症的过度炎症反应[17]。此外，维生素D还可促进巨噬细胞内活性氧和自由基的释放，破坏病毒蛋白质和细菌膜结构，从而抑制和杀伤多种病原体[18]，因自由基和活性氧增强肝脏热休克蛋白(HSP) 的表达，所以维生素 D间接促进热应激反应HSP的表达，在热应激反应时保护正常组织细胞。在结核分枝杆菌感染中，1,25(OH)2D3可通过上调甘露糖受体基因(CD206)，增强巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌，同样阻止了巨噬细胞的成熟。令人惊讶的是，1,25(OH)2D3通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路，激活自噬相关基因ATG5和BECN1的表达，诱导巨噬细胞自噬结核分枝杆，抑制分枝杆菌的细胞内生长[19]。维生素D类似物增强单核细胞TLR2和TLR4对配体的激动，诱导生成抗感染的重要的初级细胞因子IL-8[20]。此外，维生素D和TLRs之间存在相互作用，现已证明了TLRs通过直接或间接方式改变了VDR的表达。Chun等[21]发现适当的TLR1/2配体刺激人单核细胞会增加VDR和CYP27B1的表达，在体外条件下，使用抗TLR2因子可减少维生素D相关信号通路。

2.3 维生素D对T、B细胞的作用

T淋巴细胞(T lymphocyte)来源于胸腺，在适应性免疫应答中占核心地位。T细胞根据功能特征可分为辅助T细胞(helper cell，Th)、细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)、调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)。初始和静止记忆T细胞低水平表达VDR，这表明VitD也直接作用于T细胞,维生素D可通过间接影响DC表型或直接刺激T细胞从而调节T细胞反应，维生素D抑制细胞因子Th1、Th17和Th2的分布，从而改变T细胞表型和功能[22]。此外，活化的T细胞也可以增加VDR和CYP27B1的表达，使25(OH)D被转化为1,25(OH)2D3，从而调节维生素D的效应功能。

Th细胞均表达CD4+，初始CD4+T细胞因受不同抗原和细胞因子的刺激主要分化成Th1、Th2、Th17三个亚群。Th1和Th2互为抑制性细胞，Th1介导细胞免疫，主要分泌IFN-r、TNF、IL-2等Th1型细胞因子；Th2介导体液免疫，主要分泌IL-4、、IL-5、IL-10、IL-13等Th2型细胞因子。CD4+T 细胞是1,25(OH)2D3作用的直接靶点。目前大多数观点认为维生素D能抑制制抗原和凝集素刺激的初始CD4+T细胞转化为Th2，抑制Th1产生 IL-2 和 IFN-γ，导致其诱导 B 淋巴细胞分泌 IgG减少，同时促进 Th1细胞向 Th2 细胞转化，上调 Th2 细胞的活性，增加Th2分泌 IL-4、IL-5 和 IL-10，调控 TH1/TH2 免疫偏移，限制因 Th1 引起的免疫反应而造成潜在的组织损害[23]。但有少数观点和研究表明维生素D并不阻碍初始CD4+T向Th1分化,因为仅有少量研究说明维生素D是否会影响调控Th1和Th2分化的转录因子TBX21和GATA3。研究发现[24]1,25(OH)2D3抑制小鼠T细胞进而抑制IFN-γ分泌，但并未抑制TBX21 和 GATA3转录因子的水平。类似的，Rode等[25]发现维生素D对人类T细胞中TBX21的表达没有明显的影响。STAT4和STAT1信号在Th1细胞分化过程中起关键作用。Rode同时发现维生素D存在于适合Th1分化条件下激活的T细胞，没有显著影响STAT1和STAT4的磷酸化，这进一步支持了维生素D不会阻断Th1细胞的分化，考虑维生素D很可能直接影响IFNG基因的转录来调控初始CD4+T的分化。此外，Bartonkova等[26]对转染基因细胞株IZ-CYP24和IZ-VDRE研究发现，白细胞介素也能影响维生素D受体的转录，IL-4、IL-13能显著抑制CYP24A1 mRNA表达，从而间接增加维生素D代谢活性，相反IL-4、IL-13对IZ-CYP24和IZ-VDRE细胞株的CYP27B1 mrna的表达没有受到影响。

Th17主要分泌IL-17细胞因子，参与固有免疫和某些炎症反应的发生，在自身免疫性疾病发生发展中起重要作用。1,25(OH)2D3能抑制Th17细胞的反应，包括 CD4+T细胞分化为 Th17 细胞群的能力和Th17细胞分泌IL-17的功能。因此，在自身免疫性疾病中，维生素 D 可以通过对 Th17的调节发挥作用。

Treg通常所指主要是表达CD4+C425+Foxp3+的T细胞。维生素 D通过诱导DC的耐受性，减少初始CD4+T分化为Th1细胞和Th17细胞，促进初始CD4+T细胞向Treg分化[27]。Treg通过不同机制包括调节细胞因子的分泌以及T细胞活化来调控机体的免疫反应。磷脂酶C-γ1 (PLC-γ1)是TCR信号通路下游不可或缺的信号蛋白，在T细胞活化过程中起着至关重要的作用，维生素D可以显著上调PLC-γ1表达,从而诱导TGF-β1表达，最终促进Treg分化[28]。此外，Treg可直接诱导靶细胞的溶解，并削弱抗原呈递细胞对适应免疫应答的能力，通过上述机制，维生素D被认为可以调节细胞介导的免疫反应，调节T细胞的活性。维生素D还可以直接影响Treg的增殖而不抑制其功能，促进 Treg分泌IL-10，从而在自身免疫性疾病和宿主移植排斥反应中发挥重要作用。

B淋巴细胞通过产生抗体发挥特异性体液免疫，也是重要的抗原提成细胞。最初发现，维生素D可通过调节Th而间接调节B淋巴细胞，然而，人类B细胞也表达VDR和CYP27B1，它们在激活时被上调，表明B细胞也可能受到1，25(OH)2D3刺激的影响[22]。近年来发现[22，29]维生素 D 诱导B细胞的低反应性，可直接导致细胞凋亡，抑制 B 细胞的分化增殖，减少免疫球蛋白的产生，增加细胞因子IL-19的分泌，表明维生素D在 B 细胞功能紊乱性的疾病有潜在的作用。维生素D在不依赖 NF-κB条件下,可直接抑制 P65 的表达，减少 p65 与p105 启动子的连接，下调 p105 的表达，减少p105 和 p50 的蛋白水平，最终降低或抑制了B细胞的功能[30]。

总之，维生素D的活性形式可以增强固有免疫系统，调节适应性免疫系统，促进免疫耐受，减少发生自身免疫性疾病的可能性。

3 维生素D与自身免疫性内分泌疾病

3.1 维生素与自身免疫性甲状腺疾病

近年的几项研究[31]表明，维生素D缺乏与桥本甲状腺炎(HT)和Graves病(GD)等自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease，AITD)存在着联系。虽然维生素D通常被包括在导致AITD发病机制的环境因素中，但维生素D与GD之间的因果联系并不是很明确[32]。一项荟萃分析研究[33]表明自身免疫性甲状腺疾病患者血清25(OH)D水平明显低于正常对照人群，同时认为低血清25(OH)D人群更易患自身免疫性甲状腺疾病患。此外，最近一项随机对照试验[34]发现，给予AITD患者补充维生素D后显著降低抗甲状腺过氧化物酶(TPOAB)效价，产生了给予AITD患者维生素D可使其病情改善的观点。另一项荟萃分析[35]表明，低维生素D含量可能增加GD的风险，与对照组相比，GD患者更有可能缺乏维生素D。越来越多的证据表明，VDR基因多态性与AITD患病率有关。一项研究[36]对139例GD患者、116例HT患者、76名正常人群作为对照组进行基因型分析，结果显示AITD患者的ApaI多态性C等位基因的频率高于对照组(P=0.0349)，HT患者中FokI的CC基因型的频率高于对照组(P=0.0174)，GD患者中TaqI的TT基因型的频率比HT患者高(P=0.0147)，表明VD基因的遗传差异可能与AITD的发展有关。有研究[37]报道C等位基因与IL-12的分泌有关，IL-12在HD患者中诱导Th0向Th1分化，导致甲状腺破坏，因此，CC基因型可能与自身免疫性甲状腺破坏的诱导有关。

3.2 维生素D与1型糖尿病

1 型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)绝大部分为自身免疫性相关引起的胰岛β细胞的损害，导致胰岛素的绝对减少。VDR可表达于胰岛β细胞和大多数免疫细胞中。Wolden-Kirk等[38]对人类和小鼠胰岛细胞研究表明，1,25(OH)2D3几乎可以完全阻止由IL-1β和IFN-γ引起的胰岛细胞死亡，此外，这种保护还伴有基因表达的改变。 T1DM发病机制的关键Th1与Th2平衡失调和免疫耐受的破坏。笔者之前提过，维生素D通过对DC细胞或T细胞产生影响，生成具有免疫耐受的诱导与维持功能的 DCs，促使初始CD4+T细胞转化为Th2，因此，维生素D对T1DM免疫系统来说是一个强有力的免疫调节剂。在一个小的前瞻性试验[39]中，给予12个1型糖尿病高危儿童口服骨化三醇 (0.25 μg/d)，疗程达1年至3年，所有参与者的血清自身抗体谷氨酸脱羧酶自身抗体(GAD65)水平下降、胰岛素抵抗作用减弱。补充维生素D的婴儿与未补充维生素D的婴儿后期患T1DM的风险显著降低(减少29%)。在亚洲人群中，VDR的BsmI多态性与T1DM风险之间存在关联，携带者风险增加30%[40]。

3.3 维生素D与Addison’s病

原发性慢性肾上腺皮质功能减退症(chronic adrenocorical hypofunction，AD)又称Addison病，伴有其他器官自身免疫病，称为自身免疫性多发内分泌腺体综合征(autoimmune polyendocrine syndrome，APS)。目前只有少量的观察性研究调查了血浆维生素D水平和AD之间的联系。英国一项大数据研究[41]发现维生素D缺乏的患者中，患AD和其他自身免疫性疾病的比率显著升高。Bellastella等[42]证明，与健康对照组相比，APS的患者的25(OH)D水平较低(P<0.001)。一项对13名AD患者的随机对照试验[43]，AD患者接受3个月的维生素D3(4 000 IU/天)治疗后，结果显示Th细胞和CTL细胞数量下降，单核细胞数量增加，T细胞的变化与CYP27B1基因rs108770012位点多态性和VDR基因rs10735810位点多态性有关。同样的，VDR基因的多态性与AD密切相关。另一项研究[44]表明，与AD相关的APS患者出现C (-1260)等位基因的频率增加。

总之，由于1α-羟化酶和VDR同样表达于免疫细胞，结合近几年一些观察性研究和荟萃分析表明维生素D的循环水平与自身免疫内分泌紊乱疾病之间的关联，提示了维生素D的免疫调节特性。因此，维生素D不足或缺乏可能会扰乱正常的免疫反应，导致自身免疫性疾病的发展。此外，VDR与CYP27B1基因多态性和T1DM、AD、AITD较高风险的相关性，进一步暗示了维生素D在自身免疫性内分泌疾病发病机制中的潜在作用。但是，目前两者间的联系主要来源于观察性研究和动物实验，观察到的低水平维生素D可能是由于炎症状态、潜在疾病或缺乏日光照射等因素造成的偏差。因此，需要进一步严格的随机对照试验以确定维生素D与自身免疫内分泌疾病之间的因果关系，并提供有关维生素D在预防这些自身免疫性疾病中的潜在作用的信息。