不同移植途径下小鼠骨髓单个核细胞向肝脏迁移情况比较

穆丽雅 唐秀芬 孙媛媛

终末期肝病的治疗仍是临床的棘手问题, 随着干细胞研究的深入, 为肝病临床治疗方法上开辟了一条新路。13年前,自体骨髓干细胞移植已应用于临床治疗失代偿期肝硬化, 患者的临床症状及实验室检查均得以改善［1］, 相继大量文献报道［2］, 骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化均取得较好的治疗效果。失代偿期肝硬化肝功衰竭的病理原因是肝脏结构的改变, 移植的骨髓干细胞可以分化为正常的肝细胞, 若是选择时间恰当, 可以逆转肝纤维化, 骨髓干细胞可以分化为功能完备的肝细胞, 受损的肝组织对干细胞向肝脏迁移具有定向作用, 基于大量的体内外干细胞的研究, 自体骨髓干细胞移植已应用于临床, 并获得了很好的治疗效果, 为等待肝脏移植的患者赢取了更多的等待时间, 同时也能为终末期肝病患者缓解临床症状, 提高生活质量。

1 材料与方法

1.1 材料 选取雄性BALB/c小鼠80只, 体质量18～22 g,购买和饲养于哈尔滨医科大学动物实验中心。淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司), CCL4(哈尔滨市鑫鹏化学试剂厂), 2-乙酰氨基芴(2-Acetamidofluorene,Fluka Biochemika), 红色荧光染料PKH26(Sigma公司), 聚乙二醇-400(天津天泰精细化学品有限公司), DMEM(dubecco’s modifided eagle’s medium, DMEM)培养基及胎牛血清(Invitrogen公司)。将小鼠随机分为移植组(A组、B组、C组、D组, 每组10只)和供体组40只。

1.2 方法

1.2.1 将溶于聚乙二醇的2-乙酰氨基芴按20 mg/kg 灌胃(ig)共7 d, 8 d行腹腔注射(ip)1 g/LCCL4橄榄油溶液20 ml/kg, 9 d行骨髓移植, 10 d起2-乙酰氨基芴20 mg/kg 腹腔注射共7 d,制备肝损伤模型。

1.2.2 无菌手术取出供体组小鼠的双侧股骨, 用肝素生理盐水冲出骨髓, 再经过7→5号针头后, 3000 r/min离心5 min,磷酸盐缓冲液(PBS)重悬, 然后用淋巴细胞分离液分离, 吸取界面上灰白色细胞, 用PBS洗2遍, 得骨髓单核细胞, 采用4 μmol/L PKH26标记所分离出来的骨髓单核细胞, 骨髓干细胞体外标记方法按说明书操作, 骨髓干细胞移植：①台盼蓝拒染试验检验细胞活性, 均达到95%以上, 可用于细胞移植；②A组小鼠用10 g/L戊巴比妥钠以50 mg/kg麻醉后, 取腹部正中切口, 经门静脉穿刺注射骨髓单核细胞悬液0.3 ml,并用11-0无损伤缝合线缝合裂口, 同时腹腔注射1万U青霉素, 然后关闭腹腔。B组小鼠经尾静脉注入骨髓单核细胞悬液(细胞数均为3×10/只)0.3 ml。C组小鼠采用碘伏消毒右下腹部皮肤, 腹腔注射骨髓单核细胞液0.3 ml。D组小鼠同A组小鼠, 麻醉后开腹脾内注射骨髓单核细胞液0.3 ml。

1.2.3 移植2周后处死小鼠, 取所有小鼠的最大肝叶组织,置液氮中速冻, 然后置-80℃冰箱中保存, 待制备等面积的肝组织冰冻切片。

1.3 观察指标 20倍镜下, 将每张冰冻切片上的荧光标记阳性细胞数相加, 计算其平均值, 并进行组间比较。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

荧光染色组织学检查 PKH26吸收551nm的绿色激发光后发出红色荧光, 在荧光显微镜下发现, 各组小鼠肝组织切片中均可见散在的红色荧光标记, 多数分布在肝细胞索内, 提示体外PKH26标记的骨髓细胞能够移居肝脏。PKH26标记阳性的细胞在20倍镜下每张切片总数平均值A组为(175.46±20.32)个, B组为(172.92±19.45)个, C组为(169.37±18.28)个, D组为(170.89±23.27)个;各组迁移的细胞数比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

经过大量的动物实验证明［3］, 骨髓干细胞可以分化为功能完备的肝细胞, 受损的肝组织对干细胞向肝脏迁移具有定向作用, 基于大量的体内外干细胞的研究, 自体骨髓干细胞移植已应用于临床, 并获得了很好的治疗效果, 为等待肝脏移植的患者赢取了更多的等待时间, 同时也能缓解终末期肝病患者的临床症状, 提高患者的生活质量。

本次实验对四种移植途径进行对比研究, 这四种途径均是动物实验常用的移植途径。PKH26是骨髓干细胞研究中常用的标记物, 其染色快, 稳定性高, 活体细胞无毒性, 细胞分裂后标记物也会分裂, 荧光衰减的速度降低。本次实验中, 通过遗传相似性可以发现, 自体骨髓移植防止了细胞移植出现的排斥免疫问题［4,5］。实验结果显示, 荧光染色组织学检查 PKH26吸收551nm的绿色激发光后发出红色荧光,在荧光显微镜下发现, 各组小鼠肝组织切片中均可见散在的红色荧光标记, 多数分布在肝细胞索内, 提示体外PKH26标记的骨髓细胞能够移居肝脏。PKH26标记阳性的细胞在20倍镜下每张切片总数平均值A组为(175.46±20.32)个,B组为(172.92±19.45)个, C组为(169.37±18.28)个, D组为(170.89±23.27)个;各组迁移的细胞数比较差异无统计学意义(P＞0.05)。由此说明骨髓干细胞移植途径可以选择外周静脉, 其经济简单, 更易操作。

总之, 失代偿期肝硬化肝功衰竭的病理原因是肝脏结构的改变, 移植的骨髓干细胞可以分化为正常肝细胞, 若是选择时间恰当可以逆转肝纤维化, 但是是否可以改变假小叶结构仍需进一步的实验研究得以明确。