葡萄酒挥发性成分及其分析方法研究进展

杜芬妮，贾 潜，陈 露，李 翔，莫开菊

（1.湖北民族大学生物科学与技术学院，湖北恩施445000；2.湖北省恩施市国家富硒产品监督检验中心，湖北恩施445000）

葡萄酒是酵母通过发酵浆果或葡萄汁中的糖分得到的酒精度介于啤酒与白酒之间的果酒[1]。其起源于以中国为代表的远东古文明国家，后传至英法等欧洲国家，在15—16世纪由航海家传播至南北美洲、澳洲等国家[2-3]。放眼世界，顶级酒庄如法国的罗曼尼-康帝酒庄，西班牙的贝加西西里亚酒庄和美国的圣密夕酒庄等产出的葡萄酒享誉世界，其品质为葡萄酒行业树起一面旗帜。转眼国内，知名葡萄酒品牌“张裕”于2017年荣登全球最受欢迎葡萄酒品牌榜单[4]。但我国近几年葡萄酒总产量持续下降，与之相反，市场规模却大比例增长，导致葡萄酒进口数量猛增。造成这一现象的主要原因之一是我国葡萄酒品种单一，产品同质化现象严重[5]。因此，研究葡萄酒风味有利于促进形成风味各异的葡萄酒种类并稳定和提高其品质，有利于促进葡萄酒产业健康稳定的发展。随着现代仪器分析技术的发展与成熟，越来越多的对香气有突出贡献的风味化合物被分离鉴定，使人们对葡萄酒的认知越来越深入，也越来越期望通过现代技术提高和稳定葡萄酒的风格。因此本文从葡萄酒的不同产香阶段着手，总结不同类型葡萄酒中的特征性及主体风味成分，并将现代多种风味成分的分析技术特点进行阐述，以达到全面深入了解葡萄酒风味及现代分析手段的目的，为更好地研究葡萄酒风味和提高其品质打基础。

1 主要香气成分

葡萄酒的香气成分极为复杂多样，已鉴定出800多种，其种类和浓度差异使得葡萄酒的风味各有千秋。研究香气化合物产生途径及不同酒体间的风味差异产生的原因对葡萄酒加工环节的修正及优化有积极的引导作用，同时对采用新的生物技术手段构建葡萄酒的整体风格也有重要的指导意义。

葡萄酒有三类香气，一类香气为来自于原料本身的键合态和非键合态化合物，这类化合物往往为葡萄果实的次生代谢产物，非酿造过程产生，通常被认定为原料的特征果香，形成葡萄酒的特征性风味化合物[6]；二类香气是葡萄酒主要的风味化合物，在酒精发酵与苹果酸-乳酸发酵阶段产生[7]；三类香气产生于陈酿过程，此时葡萄酒各化学成分之间相互协调，主要发生氧化反应、酯化反应、聚合反应等，同时用于贮存葡萄酒的不同材料木桶的香味传递于酒体，达到丰富风味的目的[8]。

1.1 发酵前阶段

葡萄中的果香化合物主要有萜类化合物和C13降异戊二烯类化合物，它们是葡萄的次生代谢产物，在葡萄皮中含量丰富，且具有很低的感官阈值，不被酵母所代谢，在酿酒过程中转移至酒体[9]，如芳樟醇、橙花醇、香茅醇和β-大马酮等广泛存在于葡萄酒中。不少葡萄酒中特有的萜类和C13降异戊二烯类化合物可为一定种类范围内的葡萄酒的甄别提供重要依据。例如蛇龙珠葡萄酒特有的4-萜品醇为酒体提供胡椒香[10]；吐叶醇为坦纳特葡萄酒所独有[11]；霞多丽葡萄酒中特有的法尼醇为酒体提供丁香及仙来花香味[12]；雷司令葡萄酒所特有的香叶醇赋予酒体温和、甜的玫瑰花气息[13]；西西里岛麝香葡萄酒所特有的β-蒎烯是酒体中松香气味的主要来源[14]；维奈西卡葡萄酒所特有的苎烯为酒体提供类似柠檬的香味[15]；西拉葡萄酒所特有的顺式-玫瑰醚为酒体提供强烈的玫瑰、香叶香气[16]；赤霞珠葡萄酒中所特有的2-莰醇为酒体提供类似樟脑的气味，广泛用于配制迷迭香、熏衣草型的香精香料[17]；品丽珠所特有的石竹烯具有温和的丁香香气，同时还有长叶烯也常用于制备香精香料[18]。除了各原料中的特异性风味成分的差异外，一些普遍存在于原料中的成分，其浓度随品种不同也有很大差异，因而产生了风味各异的葡萄酒。葡萄酒的命名通常冠以其原料品种名，这充分体现了原料对葡萄酒特征性风味的重要贡献。

与此同时，这两类化合物也可存在于糖基化的无香气的键合态前体中，在酒精发酵过程中通过酶解释放[19]，如一些苯乙基或它们的衍生物从糖苷香气前体物质中释放出来，或通过原质体中莽草酸途径形成，如4-乙基苯酚、愈创木酚、丁香酚等，因此，这些化合物也被列为非发酵芳香化合物[20]。

1.2 发酵阶段

乙醇是通过酒精发酵产生的，在酒香气的呈现中起重要作用。除乙醇外，主要有高级脂肪醇、芳香醇及二元醇，依其种类和浓度的不同，使葡萄酒呈现不同的整体风味[21]。葡萄酒中的高级醇通过酵母酒精发酵途径或由相应氨基酸的降解代谢途径生成，作为次级代谢产物释放到酒体中[22]，浓度通常为400～500 mg/L。低于300 mg/L时，有助于提高葡萄酒香气的复杂度，但高于500 mg/L时，除2-苯乙醇外，对葡萄酒的质量可能有消极作用[23]。己醇由己醛还原而产生，并赋予酒体草本属性[24]，使葡萄酒具有“植物性”和“草本”的细微差别，当它的浓度高于其气味阈值时，通常对葡萄酒的品质有负面影响[25]。异戊醇、苯乙醇分别由亮氨酸（和异亮氨酸）、缬氨酸与苯丙氨酸的降解生成，或由丙酮酸进入氨基酸生物合成途径后形成α-酮酸中间体，再由相应的酶催化后形成[26]。其中，异戊醇可提供持久的青草，植物香气[27]。2,3-丁二醇的氧化产物3-羟基丁酮和丁二酮可作为食用香精食用，其中，2,3-丁二醇也作为我国白酒添加剂以达到改善风味的目的。

羰基化合物（醛和酮）可由两种途径形成：不饱和脂肪酸的降解和氨基酸在氧存在条件下的部分降解，此外，酮也可以通过真菌对脂质或氨基酸的酶作用产生[28]。在葡萄酒中普遍存在的乙醛有类似坚果或干果的香味；壬醛在中等水平表现出强烈的脂肪-花香气味；癸醛赋予酒体茶叶香味，使人产生爽快的感觉。

脂肪酸是形成酯、醇和醛的前体物质。同时可防止相应酯的水解，它们对于葡萄酒的芳香平衡是非常重要的。表现出强烈的酸味的短链脂肪酸，会掩盖葡萄酒中的其他香气，适宜浓度的脂肪酸可使酒体展现最佳风味[29]。如乙酸是葡萄酒中的主要脂肪酸，由酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵过程中的乙醇氧化反应产生。辛酸在脂肪酸合成酶的作用下产生，低浓度时散发出类似奶酪和奶油的风味，在高浓度时具有腐败味和刺激味，这些酸类物质对葡萄酒的整体风味结构具有较重要作用。

酯主要通过醇与有机酸的酯化形成。此外，发酵过程中酵母和其他微生物的存在也会导致酯类的产生，主要有乙酸酯和中链脂肪酸酯两大类。它们大多数都具有典型果香，赋予酒体果香气息。其中乙酸酯类化合物的酰基衍生自乙酸（以乙酰辅酶A的形式），醇基团是乙醇或复合醇[30]。在酒精发酵过程中，它们是由不同的醇乙酰转移酶合成。乙酸异丁酯由异丁醇与乙酸酯化生成，赋予酒体果香或花香味。醋酸异戊酯具有类似于香蕉和梨的香气。中链脂肪酸酯是由中链脂肪酸与乙醇形成的[31]。在酿酒酵母发酵过程中，乙酯的形成归因于酰基CoA:乙醇O-酰基转移酶[32]。其中普遍存在于葡萄酒中的乳酸乙酯有较强的酒香气味，但浓度太高，会掩盖葡萄酒新鲜的果香气味。琥珀酸二乙酯有浓郁的水果香。葡萄酒中乳酸乙酯和琥珀酸二乙酯挥发性较低，且感官阈值都相对较高，虽广泛存在，但对酒体整体香气贡献不大。而丙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、异丁酸乙酯、异戊酸乙酯[33]等化合物大多具有较低的阈值，主要是在酒精发酵的第一阶段生产，并赋予酒体绿色苹果、梨和菠萝的芳香。乙酸乙酯的香气在新生产的葡萄酒中最为突出，有助于葡萄酒中果味的总体感知，对葡萄酒的整体贡献较大。

1.3 陈酿阶段

葡萄酒在陈酿过程中，所用容器中的香气物质迁移至酒中；封闭环境下氧气总含量（酒所溶解的氧和液面空间上的氧）与醇、醛等化合物发生氧化作用；各化学组分的动态平衡反应，最终使葡萄酒趋于稳定。

橡木桶用于葡萄酒的陈酿由来已久，其化学组成和结构特征影响着陈酿阶段的物理、化学和生物进程。在陈酿过程中，来自橡木本身的香气成分转移至酒体，这类化合物中最为重要的是鞣花单宁，一般占木材芯干重的10%左右，它们进入酒体后通过缩合、水解和氧化反应缓慢而连续地生成乙基衍生物及黄烷-鞣花单宁等化合物[34]，此外橡木中的多糖、半纤维素和纤维素的降解所产生的γ-丁内酯、威士忌内酯、丁香酚、愈创木酚和呋喃甲醛、内酯及小分子挥发性物质转移至酒体[35-36]，这些物质间的协同作用为葡萄酒增添橡木香气[37]。

透氧率作为橡木桶的结构特征影响着葡萄酒中因氧化存在的两类香气变化：氧敏感芳香化合物的氧化（如硫醇）和新的芳香化合物氧化生成（如乙醛、苯乙醛、2-甲基丙醛等）[38]。3-巯基乙醇通常是葡萄酒含量最丰富的多官能团硫醇，具有热带水果香气，在贮藏一年左右时发生氧化，含量急剧下降[39]。乙醇在葡萄酒中经氧化形成乙醛，进一步与单宁或花青素结合形成乙基键合物，氧化过程使酒体的水果和发酵香味消减，氧化香味增强。葡萄酒氧化过程不仅局限于在橡木桶中贮存的阶段，大多数研究表明，瓶贮过程中木塞的选择对葡萄酒发酵后阶段的氧化香气也有深远影响[40-42]。陈酿过程中，糖苷的酸水解可以增加酒体中萜烯的成分，赋予葡萄酒更多独特的果香[43]，这个过程所释放的去甲基异戊二烯类、单萜类和倍半萜类化合物是酒体烟草香和香料香气的主要贡献者[44]。

发酵阶段酒体所含有的酯类物质将在陈酿阶段经历酯化-水解的动态平衡过程，乙酸酯通常比脂肪酸乙酯水解速度更快[45]，支链脂肪酸乙酯相较于直链脂肪酸乙酯（己酸乙酯等），由于其较弱的挥发性在酒中含量相对增多[46]，长链脂肪酸乙酯的含量总体呈增加水平，酒石酸与乙醇之间的酯化使得酒石酸乙酯含量上升[47]。此外，外界条件如时间和温度等也影响着葡萄酒香气成分的动态平衡[48]。

葡萄酒风味是一个庞大的体系，受原料的选取，酿造方式的差异及陈酿条件的影响。围绕风味化合物的研究之所以能如火如荼地开展，得益于各种样品前处理技术的发展及气相色谱高效的分离功能。

2 风味化合物的分析方法

2.1 分析方法

食品的风味成分往往是不同种类、不同浓度挥发性化合物的集合体。在气相色谱诞生之前，要完成这些化合物的分离鉴定有着难以想象的工作量，耗时费力，且样品需求量巨大。但利用气相色谱与其他检测器联用可以很轻松解决这些问题。气相色谱(GC)是以惰性气体为流动相，以色谱柱内填料或涂层为固定相，利用固定相对不同化合物的吸附力强弱来实现分离效果，吸附力弱的最先被分离出来，吸附力强的最后流出。由于其分离能力强、灵敏度高、分析速度快，常常是研究食品风味的首选方法。

气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)是将气相色谱很强的分离能力和质谱很强的鉴定能力结合起来，使得分离和鉴定同时进行。与用化合物的保留性能来定性物质的其他检测器相比，质谱仪(MS)本身就是一台有很强定性能力的独立的仪器，其与气相色谱仪的联用也最为成熟，应用也最为广泛。Ivan Španik[49]将GC-MS成功用于不同地理来源和加工方式的葡萄酒的鉴别；刘亚娜等[50]以GC-MS对D254、71B、D153种果酒酵母酿造的红树莓酒的挥发性成分进行分析，测量出其主要的香味成分，并选定最佳酿酒酵母。全二维气相色谱技术(GC×GC)是将两根色谱柱以特定方式连接于调制解调器，通过设置一定的调制时间将一维流出物捕集，聚焦后释放至二维色谱柱，此分离方法可以在极性差异上实现化合物的分离[51-52]，相较于一维来讲具有更高效的分离效能，但需要较为成熟的调制技术。Juliane Elisa Welke等[53]通过GC×GC-OFMS结合主成分分析和聚类分析得出霞多丽葡萄酒和起泡酒之间有119种不同物质，并筛选出87种决定这种差异的最主要的风味物质。Berhane T·Weldegergis等[54]用此方法将取自不同栽培技术原料，用不同酿造方法制备的匹诺奇葡萄酒的挥发性产物进行对比研究，并说明这两种因素对葡萄酒的影响。

2.2 提取方法

气相色谱虽然具有高灵敏度、操作简单等特点，但我们面临的分析对象却多种多样，组成复杂，其中不少成分因在汽化室内的高温下不能被汽化反而被碳化，进而污染汽化室和色谱柱，干扰后续实验结果。葡萄酒中含有大量水分，进入柱内会破坏毛细管柱的固定相膜，降低柱效。此外，有些风味物质在样品中浓度很低，往往低于仪器的检测限，由于其香味阈值也很低，对整体风味有重要贡献，所以测定时不能因为其浓度低而忽视其存在，有必要对样品进行浓缩富集。因此样品的预处理是保证仪器分析结果准确性的重要步骤。

在葡萄酒的风味化合物的提取方法中，液液萃取(LLE)利用样品中不同组分在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同来达到分离的目的，因气相色谱分析要求尽可能含水少，而待测成分又常常在有机溶剂中有较大的溶解度，所以它经常作为一种提取风味成分的方法。曾游等[55]通过这一方法对葡萄酒中主要风味化合物进行提取，定性定量分析结果表明，该方法有较好的重复性。同时蒸馏萃取(SDE)将蒸馏与萃取两步骤同时进行，以实现对样品中挥发性与半挥发性物质的快速提取，不仅节约时间，而且提取效果较好[56]。Eun-Ha Chang等[57]通过SDE对葡萄酒中风味化合物进行提取，分析出原料和成品之间共有的风味化合物是酯类、酮类和内酯；搅拌子吸附萃取(SBSE)为一种小型的，集萃取和富集于一身的萃取方式，有研究者指出，SBSE有极低的检测限，同时无需溶剂[58]。A.Zalacain等[59]通过优化萃取条件，成功总结出用于区分西班牙西南部6种白葡萄酒的主要香气化合物的萜烯类，C6化合物和C13-降异戊二烯类化合物。固相萃取(SPE)是一种基于液-固分离萃取的试样预处理技术，由柱液相色谱技术发展而来，自70年代后期问世以来，由于其高效，可靠及耗用溶剂量少等优点得到快速发展，其采用有高效选择性的固定相，简化了样品的预处理过程，主要用于样品分析前的净化和富集。马玥、唐柯、徐岩等[60]通过固相萃取提取同一年份不同等级的威代尔冰葡萄酒中风味化合物，发现其主要香气化合物的差异在于浓度不同，表明酿造工艺对酒体整体风味具有较大影响。顶空固相微萃取(HS-SPME)是20世纪90年代由Pawliszyn等首先提出的一种新的样品处理技术，利用固-气建立的吸附或吸收平衡原理，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，操作简便，因其已成功地与气相色谱和气质联用结合使用，是目前应用最广泛的样品预处理技术。Butkhup等[61]证明，50/30 μm DVB-CAR-PDMS萃取头对葡萄酒中的高级醇、脂肪酸和酯类具有较高的提取率。MA等[62]通过HSSPME对青梅露酒、青梅汁、青梅酿造酒的香气成分进行提取，成功分析出决定各产品独特风味的香气成分及其主要的香气成分；Azzi-Achkouty等[63]总结了近年来用HS-SPME提取葡萄酒中挥发性成分的方法条件，发现其有很高的灵敏度，可满足对低含量物质的检测。但加盐量、萃取温度、时间、萃取头类型等条件需要进一步优化以得到较好的实验结果。

陈臣等[64]通过对比研究顶空固相微萃取(HSSPME)和液液萃取(LLE)对欧李果酒中风味化合物的提取效果，发现HS-SPME适合萃取痕量易挥发成分，而LLE适合于含量较高的醇的提取。张莉[65]经SBSE和HS-SPME对葡萄酒挥发性成分提取效果的对比研究后，发现SBSE较HS-SPME在提取物的种类和数量两方面上都具有较高的提取效率。夏亚男[66]通过LLE、SDE和HS-SPME 3种方法对红枣白兰地的挥发性成分的萃取结果得知，LLE对烃类、醛酮、酸酯有较好的提取效果，HSSPME对醇和萜烯有较好的萃取结果，而SDE的萃取结果在种类和数量两方面都明显逊色于前两种方法。所以针对研究目的的不同，需对每一种萃取方法及样品的特点有了解，以选择合适的试验方法。

3 展望

风味是葡萄酒的重要特征之一，由一系列种类各异的挥发性化合物按不同的比例组成并决定葡萄酒的质量。借助仪器分析阐明产品的特征风味组成，从而形成某产品的固有风格，无疑对产品的质量稳定性和独特的商品性起到不可估量的作用。随着风味化合物的提取及分离分析方法的不断进步，将推动研究工作向更高效、快速、精准的方向发展，揭示葡萄酒香气成分的组成，将促进生产者从多角度、多阶段、多手段，有目的的去构建葡萄酒风味，丰富葡萄酒的种类，突出其特征特色，减少同质化，使葡萄酒品种异彩纷呈。