Long non-coding RNA在前列腺癌中的研究

李祥春，王新慧，卢蕻迪，张 迎，刘子玲

(吉林大学第一医院，吉林 长春130012)

LncRNA的本质是RNA，是由核苷酸组成的长链，有以下几个优势：(1)可以轻松与同源DNA/RNA序列结合；(2)可以折叠成复杂的二级结构，轻松与多种蛋白质结合。也就是说，LncRNA情商极高，与上层领导(DNA)关系暧昧，与同事(RNA)关系很铁，与下属(蛋白质)关系紧密。因此，LncRNA的表达模式在肿瘤进展过程中经常发生变化，它们的表达水平可能持续上升(如HOTAIR)，也可能稳步下降(DRAIC)。因此，LncRNA 在PCa中对肿瘤发生、发展所起到的作用,具有诊断功能、预后和预测功能。考虑到LncRNA在PCa中的动态作用，LncRNA不仅可以作为生物标志物，也可作为治疗靶点，减缓去势抵抗的发展，维持稳定的疾病，阻止转移扩散。

1 激素敏感性前列腺癌

1.1 PCA3

PCA3是在PCa中发现的第一个LncRNA，95%PCa组织中表达明显过高[1,2]。其位于PRUNE2的内反义区，在核PRUNE2/PCA3双链RNA形成后，作用于RNA 的腺苷脱氨酶与dsRNA结合，促进腺苷对肌苷的编辑，随后抑制复合物的翻译。简言之，PCA3基因的靶点之一是肿瘤抑制基因PRUNE2，PCA3和PRUNE2的表达与PCa负相关[3,4]。

研究发现，PCA3的功能并不局限于一个特定的过程。相反，它涉及多种机制，包括参与上皮-间充质转换(EMT)以及AR辅助因子对PCA3基因的调控[5]。利用siRNA或shRNA敲除LNCaP细胞中的PCA3基因，可诱导上调AR辅助因子的多个转录本编码，并调节EMT标记物的表达。LNCaP细胞通过携带shRNA序列的慢病毒载体进行转导，PCA3表达稳定下调，导致表达该转基因的LNCaP细胞比例显著下降(60%)[6]。PCA3靶向shRNA序列转导LNCaP细胞导致细胞活力丧失，支持PCA3敲除作为一种公认的抑制PCa生长的治疗方法的建议。PCA3还调控重要的癌症基因的表达，参与血管生成(VEGFA、IFNB1、COL18A1),细胞粘附(MTSS1、ITGβ1),信号转导(ERBB2、PIK3R1、MAP2K1)和细胞凋亡(BCL2L4、TERT)[5]。

在去势抵抗性前列腺癌(CRPC，Castration Resistant Prostate Cancer)中的研究发现，稳定的AR沉默表达可使血清PSA水平显著下降，原发性PCa进展到CRPC明显减缓[6]。因此，考虑到CRPC对抗雄激素治疗方法具有抗性的几个分子机制，提出稳定沉默PCA3的策略，以维持AR下调，这可能会提高CRPC患者的疗效[7]。综上，PCA3除了作为诊断生物标志物外，将来也可成为治疗靶点，特别是对治疗效果不佳的CRPC患者。

1.2 DANCR

DANCR是定位于染色体4q12的LncRNA，其长度约为850碱基。DANCR是表皮细胞去分化所必需的，其在PCa中经常过表达，并导致TIMP2/3的下调，这通常阻止肿瘤的侵袭和转移扩散[8]。此外，DANCR似乎介导EZH2(催化H3K27甲基化的KMT6)表观遗传沉默子、增强子与TIMP2/3的结合，最有可能是作为支架LncRNA。这种观察在体外也很明显，表现在PCa细胞系中的DANCR表达高于永生化的前列腺上皮细胞系[9]。

在转移方面，健康的前列腺中，雄激素-AR信号通路驱动上皮细胞的终末分化，减少DANCR水平，同时增强TIMP2/3的表达[10]。在前列腺癌中，功能性雄激素AR轴阻止恶性细胞的侵袭和转移[11]。如上所述，ADT用于激素敏感性前列腺癌(HSPC，Hormone-sensitive Prostate Cancer)的治疗，大多数Pca通过绕过下游通路激活所必需的雄激素-AR的相互作用而对常规ADT产生抗性。在这种情况下，使用恩杂鲁胺既直接靶向AR，又抑制下游信号通路。矛盾的是，恩杂鲁胺似乎能更有效地阻断雄激素-AR轴，DANCR的表达不再受到抑制，导致TIMP2/3水平降低，并开始迁移、侵袭和转移[12]。

综上，DANCR通常抑制上皮细胞的分化，抵消雄激素-AR途径在前列腺中的作用[13]，敲除DANCR可减少转移癌和侵袭性PCa细胞的比例。因此，在用恩杂鲁胺治疗期间同时阻断DANCR有可能抑制细胞迁移并防止转移扩散[14]。目前已有数据支持DANCR作为潜在的生物标志物来预测预后以及早期转移情况。但临床上仍需要更多人体数据来阐明前列腺癌中DANCR的临床相关性。

1.3 GAS5

GAS5是第一个发现在PCa细胞中起促进细胞死亡作用LncRNA[15]，GAS5的特殊结构成分-糖皮质激素响应素模拟(GREM)，作为一种诱引物，以序列特异性的方式与类固醇受体(SRs)进行交互，从而拮抗SRs介导的转化和进一步抑制细胞生长[16]。在增殖细胞中，GAS5的翻译受雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的机制靶点和无义介导的衰变(NMD)通路调控[17,18]。活跃的mTOR途径促进GAS5短阅读框的翻译,随着NMD降解这些GAS5转录物，GAS5水平降低[19]。

在PCa背景下，GAS5通过隔离复合物来促进癌细胞的死亡，并阻止雄激素-AR复合物与目标DNA的结合[20]。GAS5在mCRPC中下调，低水平的LncRNA与化疗诱导的细胞凋亡减少有关[21]。mTOR抑制剂的使用导致雄激素依赖性和雄激素敏感性PCa细胞系中GAS5的增加。临床实践中，mTOR抑制剂可用于早期PCa，通过上调GAS5来增强细胞凋亡。而mTOR抑制剂在去势抵抗性细胞中的无效性最可能与GAS低水平有关[22]。实验表明，GAS5转染22RV1和PC3细胞，细胞凋亡增加，存活率降低，可增强放疗或化疗对细胞的杀伤作用，这表明mTOR抑制剂需要GAS5用于PCa细胞的生长抑制，具有更高水平的内源性GAS5表达的PCa细胞系，例如LNCaP和22RV1，对mTOR抑制剂表现出更好的反应[23]。这意味着操纵GAS5表达有助于抑制PCa肿瘤生长并提高化疗在PCa治疗药物疗效。

GAS5 作为一种抑癌基因，其表达下调常与肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关，其低表达提示肿瘤预后不良。除此之外,GAS5 的表达能增加肿瘤细胞对化疗药物如顺铂、阿霉素等的敏感性,提示GAS5 将成为治疗新靶点。

1.4 UCA1

UCA1最初在膀胱移行癌中被发现，与增殖和凋亡有关。高水平的UCA1表达与PCa的不良预后有关，这意味着UCA1与高gleason评分、晚期TNM分期和较短的OS呈正相关[24]。有趣的是，其抑制作用可能具有治疗意义，因为使用针对UCA1的RNA可抑制增殖并可增加体外凋亡细胞的比例。这种效应部分是通过KLF4- KRT6/KRT13途径发生的，其中KLF4是一种转录因子，与分化和增殖相关，其在PCa组织中的表达也显著高于相应的非肿瘤邻近组织[25]。

另一方面，UCA1也被认为是辐射反应的重要介质之一。使用siRNA敲除策略，已经证明UCA1敲除可以提高PCa细胞株的放射敏感性和耐辐射性PCa细胞数量[25]。研究表明UCA1 和 miR-143 位于相同的RNA诱导沉默复合体(RISC)中，抑制 UCA1 的表达后直接降低 miR-143在前列腺癌中的表达活性，从而起到一定的肿瘤抑制作用[26]。UCA1既可作为一种分子标记物，对PCa放疗及预测预后有重要价值，也为PCa的诊治提供了新的参考方向。

2 去势抵抗性前列腺癌

2.1 PCGEM1

PCGEM1在超过一半PCa组织中过表达，研究发现，其表达与肿瘤恶性程度显著相关，包括分化程度、临床分期、转移等[27]。PCa细胞可以通过ADR剪接变异体，最终导致激素抵抗。七个AR剪接变异体是已知的，AR-V7具有最高的临床相关性[28]。PCGEM1在PCa组织中高达80%，并在抑制细胞凋亡的同时增强增殖[28]。ADT导致PCGEM1上调，随后重新定位到细胞核，PCGEM1与核糖核酸小体辅助因子2(U2AF65)和核不均一核糖核蛋白(hnRNP)的相互作用增强[29]。PCGEM1与hnRNP A1的结合，是AR-V7的负调控因子，降低了HNRNP A1与AR前mRNA的亲和性，并且抑制U2AF65与相同的前mRNA结合的能力[29]。因此，PCGEM1在雄激素剥夺状态下的上调导致AR-V7的表达，从而促进治疗抵抗和mCRPC的发展。

在临床实践中，不仅可用于预测恶性程度，在ADT上同时阻断PCGEM1也可提高治疗药物的疗效，这为发现新的肿瘤生物标志物及分子治疗靶点提供了新的理论依据。

2.2 HOTAIR

HOTAIR 通常受到AR的抑制，与早期PCa相比，HOTAIR在mCRPC中的表达明显过量[30]。通过与AR蛋白的N端域(NTD)结合，HOTAIR阻止了小鼠MDM2与NTD的相互作用。因此，可以防止AR的泛素化和降解[30]。此外，HOTAIR以一种与雄激素无关的方式诱导并维持AR的激活。

HOTAIR的过表达增强了去势抵抗细胞的增殖和侵袭能力。此外，在用恩杂鲁胺治疗后，LADaP细胞系中HOTAIR水平不断增高[30]。这可以部分解释恩杂鲁胺治疗期间耐药性发展的机理。在临床实践中，HOTAIR可作为抗恩杂鲁胺耐药的生物标志物。此外，同时靶向HOTAIR可能增强新型抗雄激素如恩杂鲁胺所发挥的抗增殖作用[30]。

2.3 MALAT-1

MALAT1(转移相关的肺腺癌转录因子-1)，顾名思义，首先被确定为支气管肺癌的预后因素。最近的研究表明，MALAT-1可能是一种很有前途的PCa诊断和检测的生物标志物[31]。在前列腺中，MALAT-1的表达水平在从HSPC到CRPC进展过程中显著增加[31]。MALAT-1与EZH2结合，这是PRC2复合物(Polycomb Repressive Complex 2)的核心亚基，在前列腺癌中也经常过度表达[32]。

在PCa中，DAB2互作蛋白(DAB2IP)通过增强EMT诱导剂β-catenin的降解而抑制EMT[32]。此外，MALAT-1与EZH2的相互作用也调节基因的多梳独立表达，包括跨膜蛋白48(TMEM48)和 细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基2(CKS2)。MALAT-1促进去势抵抗性细胞的迁移和侵袭，并导致DAB2IP的解除抑制[32]。对434例中国男性尿液标本的调查显示，MALAT-1对PSA水平在4-10 ng/ml之间的男性有利于前列腺癌诊断，MALAT-1评分比目前推荐的%fPSA更具有诊断准确性[31]。临床上，MALAT-1与晚期肿瘤分期、PSA水平升高和ADT抵抗有关[32]。此外，它可以作为辅助诊断PCa的非侵入性生物标志物，尿MALAT-1水平比常规PSA筛查更准确地预测PCa风险，并且可能减少1/3不必要的前列腺活检[32]。

2.4 NEAT1

在mCRPC中，通过雌激素受体α(ERα)发出的信号是绕过雄激素-AR轴的有效机制[33]，是调节肿瘤发生的重要步骤，如TMPRSS2-ERG融合基因的表达，这在ETS阳性PCa类型中经常发现[34]。此外，ERα诱导PCNA中NEAT1的转录[33]，而NEAT1无论体内还是体外均可促进细胞增殖和侵袭[33]。

值得注意的是，NEAT1水平随着他莫昔芬、比卡鲁胺或恩杂鲁胺使用而增加[33]。因此，ERα和NEAT1水平在mCRPC中显著高于原发性PCa，这表明ERα-NEAT1相互作用在促进去势抵抗中可能发挥作用。在PCa，升高的NEAT1水平与早期生化复发和转移扩散相关[33]。因此，NEAT1不仅构成PCa治疗的潜在靶点，而且可以作为早期生化复发的预后生物标志物。

为了改善PCa患者的管理，需要新的诊断、预测和预后生物标志物。理想的生物标志物应该能够检测出一种疾病的存在并预测它的进展，即，识别高危个体、预测复发、监测治疗反应。PCa，尤其是CRPC，是一种异质性疾病，我们不期望在疾病的所有阶段都能找到一个单一的生物标志物，因此需要多个生物标志物来解决每个特定的临床问题。随着PCa发病的分子机制逐渐被发现，新型抗雄激素引入临床实践，显著提高了对常规抗激素治疗抵抗患者的预期寿命。LncRNAs参与各个阶段的肿瘤进展，它们可以在雄激素缺乏的情况下保留与雄激素相关的通路，促进激素抵抗状态的进展，或者保持细胞的增殖和入侵，不受雄激素的影响。LncRNA作为治疗靶点，同样可以增强抗肿瘤药物的疗效，帮助减缓PCa的进展。

虽然已经有几个前列腺肿瘤的转录谱，但在大多数病例中测序深度仍然太低，低表达LncRNA的检测也受到影响。因此，对于LncRNA的研究来说，有必要建立一个更直接的概要文件，以便对改变的LncRNA进行完整的概述。此外，该技术对单个患者的转录组序列进行组装的高成本是一个重要的限制。因此，LncRNAs作为生物标志物的未来应用仍停留在更精确的技术上，如定向测序面板、特定微阵列、特定LncRNA的RT-qPCR分析以及原位杂交。最后，将LncRNAs引入临床实践作为PCa诊断、预测和预后具有必要性，因为LncRNAs有超强优势，其在体液中具有高稳定性，包括血液、尿液或唾液和前列腺液，使它们在易于获取并易于检测。