辅助生殖技术与印记基因疾病的研究进展

艾初初 施晓鋆（通讯作者）

（贵州医科大学 贵州 贵阳 550004）

自从1978年，世界第一例试管婴儿Louise Brown的诞生以来，辅助生殖技术逐渐成为不孕不育夫妇助孕的重要方式。ART主要包括的操作有体外受精、胞浆内单精子注射（ICSI）及植入前遗传学诊断等[2]。尽管通过这种方式使得数千万的家庭孕育了自己的孩子，但由于ART涉及到诱导排卵、配子操作等非自然受孕过程，导致配子及胚胎的医源性应激，可能会对子代产生一定的影响，其安全问题越来越引起广泛的重视。有研究显示，辅助生殖技术在一定程度上导致早产、胎儿宫内发育异常以及印记基因相关疾病的发生[3-5]。1993年以来，通过建立动物模型，发现胚胎培养会明显影响胎儿发育以及印记基因的表达[6]。大量动物模型试验和人类流行病学研究表明ART操作可能会在配子形成和早期胚胎发育时期影响印记基因调控[7]。对辅助生殖技术出生的儿童的随访研究表明，ART并没有增加先天性畸形的发生率，然而，它增加了表观遗传疾病的发生率，如BWS、AS、SRS等。ART可能与在配子发生期间或受精后立即发生表观遗传重新编程的基因组印记异常风险增加有关[8]。

1.印记基因

生殖遗传是指通过两性生殖细胞内染色体上的基因，将遗传信息代代传递下去，使得子代具有亲代的表型特征，遵循孟德尔遗传定律[9]。而由沃丁顿于1942年首次提出的表观遗传学则主要研究的是在不改变DNA核苷酸序列的前提下基因表达发生改变的机制，具有不遵循孟德尔遗传定律、获得遗传改变表观遗传的特点[10]。基因组印记是对基因组进行表观遗传修饰的表观遗传过程，即在不改变DNA序列的情况下，沉默一个亲本等位基因，只表达单等位基因[11]。其中，父系等位基因不表达者就称为父系印记，而母系等位基因不表达者则称为母系印记。目前发现的父系印记基因主要包括：H19、IGF2R、TSSC3、MASH2、GRAB10等，母系印记基因则主要包括：IGF2、PLAGL1、MEST、PEG等[12]。印记基因在胎儿的生长发育中有重要的作用，来自小鼠模型和罕见的人类印记障碍的证据表明，父系表达的基因有促进胎儿生长的作用，而母系表达的基因则抑制胎儿生长。有研究发现，胰岛素样生长因子轴和IGF2/H19位点胰岛素/IGF生长因子轴包括胰岛素（INS）、IGF1、IGF2及其相应受体（IR、IGF1R、IGF2R）和6个结合蛋白（IGFBP16），是影响出生前后生长的关键调节的内分泌因子。IGF2R位于人类染色体6q25.3，主要功能之一是溶酶体靶向和降解IGF2，从而起到抑制生长的作用。IGF2和H19位于人类11p15染色体上，它们的相互印迹是由印迹控制区1（ICR1）的差异甲基化控制的，通常只在父系等位基因上甲基化。未甲基化的母体ICR1可与CTCF转录因子结合，阻断IGF2启动子对H19下游增强子的通路，从而激活H19表达。相反，CTCF蛋白被阻止与父系甲基化的ICR1结合，导致IGF2启动子与增强子相互作用，导致单等位基因的父系IGF2表达。大约50%的生长受限SRS病例在ICR1处甲基化缺失，这可能导致SRS的生长受限[13]。在哺乳动物的发育过程中，基因组信息有两次大规模的重新编码阶段，主要是表观遗传修饰的改变。第一个时期主要在原始生殖细胞的发育过程中，DNA去甲基化消除表观遗传修饰，然后在配子的成熟过程中再重新甲基化，加上印记标识；第二个时期则主要发生在早期胚胎植入阶段，虽然这个时期DNA进行大规模的去甲基化改变，但是印记基因甲基化水平并不改变[7]。甲基化水平变化最强烈的阶段在配子形成和早期胚胎发育时期。如果在此期间发生不完全去甲基化或者过早发生再甲基化，可能会导致胚胎的死亡或者在子代出生后发生各种遗传病[14]。ART操作可能会在配子形成和早期胚胎发育时期影响印记基因调控，印记基因igf2/H19异常甲基化可能会引起一些生长障碍，例如BWS、RSS、宫内和产后生长迟缓综合征等，通过ART技术出生的孩子患BWS综合征的比例相对较高[15]。Soejima等也提出BWS与印记基因igf2/H19有关[16]。对配子及早期胚胎的研究结果显示：ART操作不仅会引起低甲基化，而且会引起高甲基化，不仅会引起父源等位印记的异常而且会引起母源等位印记的异常[17]。ART目前还不能在精卵受精之前鉴别精子和卵细胞中染色体的表达是否完全正常，也不能确定原来正常的精子与卵细胞在受精时是否会出现异常。精子和卵细胞结合受精的过程是表观遗传修饰重置的关键阶段之一，若在受精过程发生变异也可能会传给子代[7]。有研究显示，男性不育患者中精子的基因甲基化发生了改变，并且可能传递给子代[18]。而ICSI技术可能会增加印记疾病发生率，不成熟的精子可能尚未建立适当的印记或甲基化因而被注入受精后影响胚胎发育[19]。有报道一位男性不育患者经ICSI技术出生的女婴患RSS，其甲基化研究显示父源性igf2/H19印记基因区域呈低甲基化中状态。进一步证明，ART可能与父源性等位基因突变有关[20]。

2.辅助生殖技术与印记基因疾病

2.1 ART与BWS

BWS综合征，又称脐膨出-巨舌-巨体综合征，是一种先天性过度生长综合征，主要临床变现为巨大儿、巨舌、新生儿低血糖、中线腹壁缺损等[21]。据估计BWS的发病率至少为1∶13700[22]。BWS由11p15.5区域母源或父源性印迹基因表达缺陷所致，与BWS相关的染色体印记区域包括：IGF2/H19、CDKN1C/KCNQ1OT1。KvDMR1去甲基化异常会引起KCNQ1QT过度表达，从而导致KCNQ1和受其调节的CDKN1C基因表达下降，而CDKN1C是一种生长抑制基因，表达下降会导致临床出现过度生长；而H19DMR甲基化会引起BWS疾病[23]。有报道体外人工辅助生育技术授精儿童BWS的发生率较正常授精儿童为高[24-25]。目前发现ART可能会增加BWS发生率，采用ART怀孕的母亲产出BWS患儿的机率是4.6%，而正常怀孕产出BWS患儿的机率是0.8%[26-27]。在7例ART出生的BWS患者中，5例是通过ICSI出生的，而检测发现，有四例发生LIT1基因改变，1例发生H19、LIT1的印记基因异常[28]。

2.2 ART与SRS

SRS综合征，又称不对称身材-矮小-性发育异常综合征。主要临床表现为胎儿严重宫内及出生后生长发育迟缓、喂养困难、特殊面容、不对称身材等[29]。关于SRS的病因，目前较明确的两个分子机制是7号染色体母源单亲二倍体（mUDP7）及11p15 ICR1低甲基化。可能为7号染色体上的母体生长抑制因子过度表达以及父源促生长基因低表达或失表达所致[30]。有研究发现SRS的生长受限表型可能涉及igf2等促生长因子的缺失[31]。在普通人群中SRS的发病率为1/50000-1/100000[32]，而法国一项研究了15162例通过ART出生的子代中，出现了6例SRS患儿，发病率较自然妊娠者高[33]。说明ART操作可能会影响该疾病的发病率。

2.3 ART与AS

AS综合征，又称快乐木偶综合征，是一种较为罕见的严重神经精神系统疾病。主要临床表现为发育迟缓、智力低下、孤独内向、吞咽困难、语言和运动功能障碍、癫痫等症状[34]。AS的自然发病率为1/50000～1/24000[35]。AS的发病与染色体15q11-q13区段中SNURF/SNRPN簇中UBE3A基因的异常有关。通常正常人脑组织中的母源性UBE3A基因表达，而父源性的相对沉默[36]。人类15号染色体的母系甲基化印记建立在受精时或之后，在此期间发生印记基因的缺失较多见[37]。而ART技术的操作较多在此时，可能会导致异常的印记建立。一项来自英国的研究发现，75例AS患者中有3例是通过ART出生的，并且这3例AS患者均存在SNRPN印记基因异常，推测与ART相关的AS是由于印记基因的异常甲基化引起的[38]。

辅助生殖技术在为人类克服生殖障碍的价值显而易见，但是在ART的操作中涉及体外受精、ICSI、胚胎体外培养、超促排卵等关键技术，任何一个环节都有可能会干扰印记基因的表达，从而可能会导致印记基因相关疾病。目前ART与印记基因失调所致的疾病的发生机制尚未明确。也有研究提出印记错误早就存在于精子或卵细胞中，没有证据表明IVF/ICSI与印记疾病有必然的因果关系[39]。正是由于ART的应用越来越广泛，ART对子代的安全性问题将更加值得探究，以便造福人类。