加巴喷丁对脊神经结扎大鼠神经病理性疼痛的作用及其机制

李涛，吴越

（ 大连医科大学附属第一医院 1. 神经外科；2. 麻醉科，辽宁 大连 116011）

加巴喷丁是γ-氨基丁酸衍生物，近年来临床上用于慢性疼痛 （尤其是神经病理性疼痛） 的治疗。研究［1］显示不同病因的神经病理性痛其治疗效果也不同。神经病理性疼痛的动物模型常用脊神经结扎 （spinal nerve ligation，SNL） 模型，SNL能直接诱发神经病理性疼痛［2］。TANGA等［3］2005年首次发现Toll样受体4 （Toll like receptor 4，TLR4） 在神经病理性疼痛模型中发挥重要作用。有研究［4］报道TLR4抑制剂FP-1能够降低大鼠外周神经损伤所引起的疼痛。已有研究［5］证明加巴喷丁能够抑制糖尿病大鼠背根神经节 （dorsal root ganglion，DRG） 中TLR4的表达，从而缓解糖尿病大鼠的神经病理性疼痛。本研究探讨加巴喷丁对大鼠神经病理性痛的作用及其对DRG中TLR4表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂、动物及分组

TLR4小鼠一抗 （美国Abcam公司）、β-actin抗体 （美国Cell Signaling公司）、 BCA 蛋白分析试剂盒 （中国碧云天公司）。加巴喷丁 （美国Sigma Aldrich公司，CAS编号：60142-96-3） 制备生理盐水溶液 （50 mg/kg） 供腹腔注射应用。雌性SD大鼠36只，体质量200～220 g，由大连医科大学附属第一医院动物实验中心提供。正常室温喂养，照明/黑暗各12 h。动物使用遵照大连医科大学动物管理委员会要求。大鼠随机均分为3组：假手术组 （Sham 组）、SNL组和加巴喷丁 （GBP组），每组12只。

1.2 SNL大鼠模型制备及手术操作

SNL组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠 （50 mg/kg） 麻醉后，在左侧L4-6沿脊柱切开皮肤，分离肌肉，暴露出L6脊椎横突，使用4-0医用缝合线在近段结扎L5脊神经，然后剪断远端，最后将肌肉皮肤依次缝合。Sham组大鼠除不结扎L5脊神经，其他操作与SNL组相同。GBP组大鼠的手术操作与SNL组相同，并行手术完成时腹腔注射加巴喷丁 （50 mg/kg）。

1.3 大鼠机械疼痛阈值测定

在术后第1、3、5、7、14天，使用机械缩足阈值 （mechanical withdrawal threshold，MWT） 来测量大鼠机械疼痛程度。将大鼠放在1个有机玻璃盒中 （12 cm×12 cm×16 cm），有机玻璃盒放置于金属网上 （0.5 cm×0.5 cm）。使用Von Frey丝 （直径200μm） 垂直扎大鼠的左足底，当大鼠后足突然扬足、缩足或舔足为阳性。刺激间隔8 min，重复5次，计算平均值。

1.4 大鼠热痛阈值测定

分别在手术前，手术后1、3、5、7 d检测大鼠后足对热痛刺激的反应。通过检测大鼠后足底对热刺激产生的缩腿动作时间 （thermal withdrawal latency，TWL） 来测量热痛阈值。将大鼠独自放在底部厚度为0.2 mm的有机玻璃盒 （18 cm×18cm×36cm） 中，适应环境20 min后，使用热辐射疼痛刺激器 （BME-410C，天津伯尔尼科技有限公司） 在玻璃板下10 cm聚焦大鼠后足底，当大鼠产生缩足或舔足反应停止照射，记录起止时间。间隔时间＞8 min，重复5次，取平均值作为TWL。为防止大鼠足底皮肤损伤，设定最高阈值为20 s。

1.5 Western blotting 检测

术后7 d大鼠腹腔注射戊巴比妥钠 （50 mg/kg） 麻醉后，断头处死，于冰上快速取L3～5DRG。使用匀浆器，加入蛋白裂解液，将DRG匀浆裂解20 min后，用移液器将蛋白裂解液移至1.5 mL EP管中，4 ℃高速离心15 min后，取上清液，采用BCA法检测样品蛋白浓度，用裂解液配平。加入5×上样缓冲液，煮沸8 min。上样电泳，浓缩胶80V 40 min，分离胶120 V 80 min，转膜 100V 60 min，将蛋白转移到PVDF膜上。5% 脱脂奶粉封闭1 h后，一抗anti-TLR4 （1∶100），anti-β-actin （1∶5 000），4 ℃孵育过夜；室温TBST洗3次，5 min/次，加入HRP兔抗鼠二抗 （1∶1 000），室温孵育1 h；TBST洗3次，5 min/次；ECL发光液发光。计算成像后蛋白条带灰度值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠MWT、TWL比较

结果显示，大鼠进行SNL手术前MWT的基础阈值是20.5 g。与Sham组比较，SNL组、GBP组大鼠手术1、3、5、7 d后MWT持续降低 （P ＜ 0.05），具有时间依赖性；与SNL组比较，GBP组大鼠手术3、5、7 d后MWT明显升高 （P ＜ 0.05）。见表1。

术前1 d大鼠TWL Sham 组 （12.28±0.8）、SNL组 （11.96±0.7）、GBP组 （12.64±0.8） 比较差异均无统计学意义 （均P ＞ 0.05）。与术前1 d比较，Sham组 （1、3、5、7 d），SNL组和GBP组大鼠 （1，3 d） TWL比较差异均无统计学意义 （P ＞ 0.05）。与Sham组比较，SNL组、GBP组大鼠术后5、7 dTWL均降低 （P ＜ 0.05） ；与SNL组比较，GBP组术后5、7 dTWL升高 （P ＜ 0.05），见表1。

2.2 各组大鼠 Western blotting 检测结果

结果显示， Sham组、 SNL组、 GBP组大鼠DRG中TLR4表达分别为1.0±0.0、1.9±0.6、1.2±0.5。与Sham组比较，SNL组TLR4表达明显增加 （P ＜ 0.01） ；而GBP组TLR4表达无明显变化 （P ＞ 0.05） ；与SNL组比较，GBP组TLR4表达显著减少 （P ＜ 0.01）。见图1。

3 讨论

加巴喷丁是一种新型用于治疗神经病理性疼痛的药物，但其缓解疼痛的机制尚不明确。研究［3］表明TLR4在疼痛的产生中发挥重要的作用，TLR4拮抗剂能缓解神经病理性疼痛。有研究［6］表明，TLR4在神经病理性疼痛动物模型中发挥重要作用，与肽类和非肽类DRG初级感觉神经元共表达，并与神经元兴奋性的增高相关。TLR4下游信号通路核转录因子、P38 MAPK参与痛觉过敏的形成过程［7］。

本研究结果显示，结扎L5脊神经能够激活TLR4 相关的痛觉敏化通路，表明TLR4在SNL引起疼痛中起着重要的作用。SNL大鼠DRG中TLR4表达增加，TLR4可能与SNL诱发的疼痛相关，加巴喷丁可以降低DRG中TLR4表达，有可能通过阻断TLR4的下游通路发挥缓解疼痛的作用，其可能机制是在大鼠神经病理性疼痛的模型中，通过抑制TLR4下游的MyD88依赖性信号通路来缓解神经病理性疼痛［8］。另有研究［9-10］表明脊髓中ANXA0/NF-kB/MMP-9信号通路与前炎症细胞因子活化在SNL诱导的神经病理性疼痛中发挥重要作用；SNL （L5结扎） 模型L5DRG中Nav1.7蛋白表达降低［10］。

综上所述，加巴喷丁能够缓解神经病理性疼痛，降低SNL大鼠DRG中TLR4表达。TLR4是天然免疫反应的第一道防线，其下游具有复杂的信号通路，加巴喷丁如何影响信号通路仍不清楚，需要进一步研究论证。