脑脊液检测在结核性脑膜炎早期诊断中的研究进展

王赛赛 马艳 刘洋

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的以脑膜为主的非化脓性炎性疾病。虽然TBM仅占结核病的1%左右[1]，但却是结核感染最严重的表现形式，具有较高的发病率和死亡率[2]。由于TBM早期症状不典型，误诊率多在30%左右[3]，常被误诊为化脓性脑膜炎、新型隐球菌性脑膜炎(cryptococcul neoformans meningitis，CNM) 和病毒性脑膜炎(viral meningitis，VM)等，导致早期诊断困难，延误治疗，显著降低患者预后质量。有研究表明，50%的TBM患者最终导致死亡或遗留严重的神经系统后遗症[1]，多发生在起病的6个月内[4]，认为与诊断和治疗的延迟有关[5]。故早期诊断及鉴别诊断TBM并及时行抗结核药物治疗，对减少并发症、提高治愈率、降低死亡率有重要意义。目前的诊断方法主要基于脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)MTB细胞学的检测及MTB侵入机体后CSF发生的一系列生物化学和微生物学变化，是诊断TBM的基础。因此，笔者通过整理近年来检测CSF方法的文献，进行分类综述与总结，为早期诊断与鉴别诊断TBM提供理论依据。

TBM的早期诊断

一、CSF细菌学检测

(一)抗酸杆菌涂片镜检

抗酸杆菌涂片镜检是实验室诊断的基础，具有操作简单、价格低廉、报告结果快等优点。最早由埃利希(Ehrlich)在1882年发明，但诊断MTB的准确性并不理想；改进后的齐尔-尼尔森染色法(Ziehl-Neelsen染色法，Z-N染色)虽阳性检出率仅提高至10%～20%[6]，但仍在临床中广泛应用。有研究表明，该染色法检测TBM患者的CSF时，需每毫升CSF中至少有5000～50 000个MTB[7]，且标本量约为10～15 ml，但由于MTB致病机制的特殊性，CSF含菌量平均每毫升仅10个左右[8]，远远不能满足检测的需要，导致其诊断的准确性较差。

为提高涂片镜检的敏感度，研究人员不断优化标本采集程序、标本加工和显微镜技术等[9-11]，但因标本采集及加工的局限，显微镜的改进成为研究重点。荧光显微镜是Z-N染色的标准诊断方法，与传统的Z-N染色相比，不但可提高敏感度(痰液检测时约提高10%)，还可减少检测时间；发光二极管荧光显微镜(light-emitting diode fluor escence microscopy，LED-FM)因在结核病各标本中的检测敏感度高于常规荧光显微镜，且较氟化铬染料(金胺-O或金胺-罗丹明)的荧光显微镜更为便宜而应用广泛[11-12]，但在肺外结核样本中的准确度还需进一步验证[12]。

(二)MTB培养

CSF标本中MTB的培养已成为确诊TBM、判断新开发检测方法的可行性和诊断价值的金标准。CSF培养较抗酸杆菌涂片镜检更为敏感，是目前诊断TBM特异度(100%)最高的方法[13]；但与CSF涂片镜检一样受CSF中MTB含菌量少，以及培养耗时长、需要3级生物安全实验室、敏感度低等影响，对TBM的早期诊断价值受限。其主要培养方式有固体培养和液体培养，传统的固体培养方法因4～8周的培养时间而失去早期诊断意义；而近年来的液体培养方法，如BACTEC MGIT 960系统、BACTEC TB 460系统、MB/BacT系统和ESP系统Ⅱ等，虽较传统培养法可以明显缩短培养时间(至少10 d)，且敏感度达到16%～51%，但仍不足以满足早期诊断[4]。2011年WHO推荐的显微镜观察药物敏感性技术(microscopic observation drug susceptibility，MODS)[14]是2000年Caviedes等建立的一种MTB实验室快速诊断和耐药性测定技术，仅需1周即可获得MTB培养及耐药性检测结果，快于商业固体或液体培养基[15]，敏感度可达65%[14]，在缩短检测时间、降低检测成本上具有优势[15-16]，但因受无菌实验室条件的影响，目前仅应用于TBM患者的药物敏感性分析[17]。

二、分子生物学检测技术

(一)聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)

核酸扩增技术(nucleic acid amplification tests，NAAT)因可以检测到少于10个微生物的标本而被用于临床标本或培养中识别MTB[18]，并于1990年首次采用CSF标本诊断TBM[19]，由此产生的多种PCR检测方法因快速、敏感度和特异度高而在TBM诊断应用方面具有较广阔的前景。常规PCR对MTB检测的敏感度为31%～100%，特异度为66%～100%[20]；但因该法只能定性检测及扩增产物易受污染的原因而改进为实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)、多重PCR(multiplex polymerase chain reaction，mPCR)、巢式PCR(nested PCR)等方法。

FQ-PCR是美国食品药品监督管理局(Food and Durg Administration，FDA)承认并推崇的诊断技术，具有缩短操作及检测时间、定量检测、降低交叉感染风险的自动化检测优点[21]。相较于CSF涂片镜检、固体培养和液体培养，具有较高的敏感度与特异度[22]。de Almeida等[23]的研究还显示了当循环阈值截断值(cut-off值)≤39.5时可提高FQ-PCR检测CSF样本中MTB的诊断性能，提示将传统的微生物检测和临床算法相结合可提高其诊断价值。最新研究评估了4种DNA提取方法(苯酚-氯仿-硫氰酸酯胍、硅胶-硫氰酸胍、树脂、乙醇树脂)及FQ-PCR扩增的3种靶点(IS6110、MPB64、hsp65KDa)对诊断TBM的价值，结果表明苯酚-氯仿-硫氰酸酯胍的提取方法联合IS6110靶点检测的效果最佳(敏感度为100%、特异度为98%)[24]，提示可通过最佳提取DNA和特异性靶点相结合检测以提高FQ-PCR对TBM的诊断准确度；但对于缺乏某一靶点的MTB菌株则难以检测出来，因此mPCR技术显得尤为重要。

mPCR通过在同一反应体系里加入2对及2对以上的引物实现对多个核酸片段的扩增，在提高通量、保持高特异度和高敏感度的同时能大大降低成本、节省样本，更加简单、快速和高效。其诊断TBM价值高于CSF涂片镜检和培养[25]，敏感度高于单相PCR。多项研究已证明，多引物联合的mPCR诊断TBM较单相PCR更有价值[26-27]。当采用IS6110和16S rDNA序列对TBM与细菌性脑膜炎(bacterial meningitis，BM)进行诊断及鉴别诊断时，其阳性率为100%、特异度为96.5%[28]。然而，因mPCR的敏感度受到待测标本数量的影响[29]，及对实验操作人员专业水平的高要求而难以在临床中广泛开展。

巢式PCR是使用2对PCR引物进行2个周期PCR反应的技术，第1对PCR扩增片段与普通PCR相似，第2对为结合在第1次PCR产物内部的巢式引物，可减少非特异性扩增造成的污染。其DNA扩增的敏感度和特异度明显高于传统的单步PCR[30]；诊断TBM的敏感度高于CSF涂片镜检、罗氏固体(L-J)和BacT/ALERT培养[31]。但由于巢式PCR有较高的假阴性和假阳性率，不能作为启动或终止TBM治疗的标准，需结合临床表现、影像学及细胞学和微生物学检查结果综合判断[31]。近年来，该技术与FQ-PCR 和mPCR等相结合，均取得较好的临床诊断结果[30，32]。

(二)环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)

LAMP技术是2000年日本学者Notomi等[33]发明的一种新的核酸体外扩增技术，可以在恒定温度下单支试管中扩增DNA，避免了PCR的热循环，使其更适合于资源有限的环境[34]。与PCR相比，检测MTB的下限提高了10倍[35]，更适用于含菌量较低的标本检测；与FQ-PCR相比，尽管检测MTB的敏感度相当，但检测时间仅1 h，且无需昂贵的检测仪器[36]。在LAMP首次应用于TBM诊断的研究中发现，以插入序列IS6110设计的6条引物诊断TBM的敏感度(88.23%)和特异度(80%)优于巢式PCR(分别为52.9%和90%)、CSF涂片镜检和培养[36-37]。最新的Meta分析也证实了LAMP诊断肺外结核的准确性，且该技术操作简单，对于缺乏经验的实验技术人员培训后即可开展实验[38]。

(三)线性探针技术(line-probe assays，LPAs)

LPAs是基于mPCR原理，并将PCR扩增、反向杂交、膜显色技术合为一体的快速诊断结核病及药物耐药性的实验方法。具体包括分子线性探针法(INNO-LPA)、Geno-type MTBDR分子线性探针法、自身免疫性诊断MTB耐药分子线性探针法(the autoimmun diagnostika TB resistance line probe assay，AIDLPA)和反向杂交MTB耐药分子线性探针法(the REBA MTB-rifa@assay，REBA-LPA)[39]，四类方法检测MTB及其耐药的效果相当[40]。2008年WHO正式推荐使用LPAs检测肺外结核标本[41]，但不同研究对于TBM诊断的结果相差较大[42-44]，这可能是CSF标本含菌量较低、目的基因扩增量少和DNA提取过程易受外界影响等原因造成。同时LPAs还存在操作复杂、价格昂贵、探针有限、需要专用PCR空间降低污染的风险，以及污染问题的处理比较棘手、需要适当的基础设施及技术熟练的实验员等问题，其早期诊断的价值有待进一步研究。

(四)GeneXpert MTB/RIF检测技术(简称“GeneXpert”)

GeneXpert是一项全自动半巢式FQ-PCR体外诊断技术，只需2 h即可同时实现MTB定性和利福平(RFP)耐药性检测[45]，与传统培养方法有相似或更高的收益，报告结果更快，更适用于早期诊断[46]。2013年WHO用于成年人和儿童肺外结核及疑似TBM患者的CSF检测诊断[47]。但因研究数据质量较低[47-48]、阳性预测值和阴性预测值较低[49-50]，以及需CSF标本量大等原因使得GeneXpert对TBM的诊断价值有所不同，需要重新评估。强调增加CFS标本量、改进和标准化CSF标本处理以获取最大化的诊断敏感度和特异度[51-53]。此外，在资源有限的环境中实现GeneXpert检测也有局限和挑战[54]，尤其在HIV感染高发的地区，检测TBM的敏感度可低至36%[53]。2017年WHO建议新一代的GeneXpert MTB/RIF Ultra替代GeneXpert，可使GeneXpert单元检测限从114个/ml菌落降低到15.6个/ml，提高了检测敏感度[55]，弥补了CSF中MTB较少的不足，但同时也降低了特异度[56]，将之作为优先初步诊断方法应更为谨慎。

三、免疫学检测技术

(一) γ-干扰素释放试验(interferon-gamma release assays，IGRAs)

IGRAs作为国际上筛查潜伏性结核感染的最新方法已上市10余年，主要通过测定早期分泌靶抗原6(ESAT-6)、培养滤液蛋白10(CFP-10)刺激外周血单核细胞产生的γ-干扰素水平来诊断结核病，但因诊断TBM所需CSF标本量大(>2 ml)、结果准确度不高(15%)、耗时较长等原因无法作为早期诊断的确诊方法，但可以作为辅助手段服务于临床。

虽然IGRAs对肺结核的诊断价值有限[57]，但其在局部特异性淋巴细胞上的应用可能具有诊断价值[58]。一项最近的Meta研究，分析了近几十年包括8项血液标本和6项CSF 标本的IGRAs诊断TBM的方法[59]，汇总敏感度、特异度分别为78%和77%、61%和88%，且CSF标本的特异度高于血液。但也有研究认为，二者敏感度与特异度受阈值(cut-off value)的影响较大，总体ROC曲线下面积对估计总体诊断价值应更为可靠。有研究表明，采用血液标本与CSF 标本的IGRAs法诊断TBM的ROC曲线下面积均低于采用NAAT[60]和腺苷脱氨酶(ADA)[61]进行诊断时，且诊断时间(约为16 h)长于NAAT和ADA[62]，提示采用血液标本与CSF标本的IGRA法的整体诊断价值可能低于NAAT和ADA。

(二)抗原抗体检测技术

CSF中MTB抗原抗体检测的研究已开展30余年，主要的抗原有GlcB、HspX、白细胞介素等，主要的抗体有抗-19 kD、抗-38 kD、抗-ESAT6、抗-抗原5等。Haldar等[63]对532例印度TBM患儿采用FQ-PCR和抗原抗体方法(GlcB、HspX、MPT51、Ag85B和PstS1)检测CSF中MTB进行前瞻性诊断评估，发现GlcB、HspX和MPT51抗原检测的敏感度和特异度分别为92%～95%和93%～96%，且与FQ-PCR联合检测时可确诊所有TBM患者，特异度极高。Huang等[64]Meta分析了近年来基于CSF中抗体检测的TBM诊断方法，纳入的36篇文献(58项研究)中抗体检测的敏感度为0.75(95%CI：0.66～0.82)，特异度为0.98(95%CI：0.96～0.99)，ROC曲线下面积(AUROC)为0.97(95%CI：0.95～0.98)；在亚组分析中，抗-M37Ra(AUROC=0.99; 95%CI：0.98～1.00)检测高于抗-抗原5[AUROC=0.99，95%CI：0.97～0.99]和抗-M37Rv[AUROC=0.97，95%CI：0.95～0.98]，对TBM的早期诊断具有重要意义。但由于对中枢神经系统感染后宿主和细菌的反应知识不完整，该方法的应用具有严重的局限，未能转化为常规的临床检测。

(三) 腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)检测

机体感染MTB后，T淋巴细胞介导的细胞免疫调节失衡，由此生成的ADA广泛分布于体液中。在正常CSF中ADA水平为 6～8 U/L，而在TBM患者中可升高至31.2 U/L[65]，因此可通过检测CSF中ADA的含量来诊断TBM，具有较高的敏感度与特异度[66]。但不同地区ADA的cut-off值具有较大差异[67-68]，不能确定合适的cut-off值来鉴别TBM和细菌性脑膜炎(BM)[69]。目前，我国对ADA诊断TBM的cut-off值尚无统一界定。尽管ADA的检测是一项简单、快速、廉价的诊断方法，但TBM患者CSF中ADA的升高并非特异性，尤其在并发HIV感染的患者中诊断价值更为有限[69]。

(四)皮质醇检测

皮质醇是压力刺激(如感染、创伤或大手术)后肾上腺产生的一种脂溶性小分子，在剧烈的压力条件下可迅速产生，且可长时间(几天至几个月，甚至几年)保持在较高水平[70]，具有快速、成本低等优势，但其诊断TBM的准确性有待于进一步研究。Holub等[71]发现BM患者CSF中的皮质醇水平升高，且与疾病严重程度相关。Mahale等[72]对20例TBM患者、20例无菌性脑膜炎(AM)患者和25例无神经障碍的对照组患者检测CSF皮质醇水平时发现，TBM患者平均CSF皮质醇水平(8.82 μg/dl)明显高于AM组(3.47 μg/dl)和对照组(1.05 μg/dl)(P值均<0.001)，同时CSF检测还可发现有蛋白质升高、低血糖和淋巴细胞增多症等结果；而AI-Mendalawi[73]的研究就CSF中皮质醇的cut-off 值未能在印度临床环境中得到实际应用，及ADA替代皮质醇方法有优势等原因，对Mahale等[72]的观点持怀疑态度，说明CSF中皮质醇的检测意义还需深入研究。

四、蛋白质组学和代谢组学检测技术

蛋白质组学技术是联合双向电泳和高分辨率质谱(mass spectrometry，MS)对疾病的相关蛋白质进行大规模筛选的技术。Yang等[74]采用iTRAQ标记结合液相色谱串联质谱(iTRAQ-LC-MS/MS)的定量蛋白组学技术，在TBM组和健康对照组CSF中共鉴别出81种差异蛋白，蛋白印迹实验(western blotting，WB)验证结果指出TBM患者潜在生物标志物尼尔样-2型分子(Nel-like type 2 molecule，NELL-2)水平显著下降，敏感度和特异度分别为83.3%和75%，具有良好的诊断效能。Kumar等[75]采用同样方法不仅能识别出已知的差异蛋白信号调节蛋白α(SIRPA)和蛋白质二硫键异构酶家族A成员6(PDIA6)，还能识别出新型过表达蛋白双载蛋白(AMPH)和神经束蛋白(NFASC)，以及下调的铁蛋白轻链(FTL)，并对新型差异蛋白进行验证。然而，这些差异蛋白的研究都是基于小样本资料，若应用于临床诊断TBM还需大样本多中心的研究进行证实。

代谢组学是对生物样品中代谢物综合图谱进行定量分析的研究，不仅可为疾病的代谢途径提供新的见解，还可确定潜在的疾病标志物[76]。该方法已用于TBM的研究，目前主要为核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)谱和MS分析平台。尽管NMR是高度量化和可重复的，但较低的敏感度大大限制了其在代谢组学中的应用；MS通常与各种色谱系统组合，敏感度和分辨率均高于NMR[77]。气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)氨基酸谱的分析可准确识别出TBM患者中丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸和脯氨酸的升高[78]，有助于TBM的早期诊断和治疗。但目前的分析技术无法实现对所有低相对分子质量代谢物的鉴别和定量，大多数研究的目的主要是获得TBM发病机制的生物学解释，而不是确定诊断价值。因此，诊断TBM的潜在标记物还需大样本研究进行验证。

TBM的鉴别诊断

一、TBM与化脓性脑膜炎的鉴别诊断

TBM是MTB引起的脑膜非化脓性炎性疾病，与化脓性脑膜炎相比，检测化脓性细菌感染后升高的指标是最直接的鉴别方法。C-反应蛋白(CRP)在化脓性细菌感染4～6 h内迅速增加，上升速度快于TBM，30～50 h达到高峰值，可为正常值的100～1000倍，其半衰期短，约4～6 d[79]；且CRP水平不受放疗、化疗、糖皮质激素治疗的影响，对鉴别早期感染性疾病的效果优于CSF中有核细胞分类计数及早期蛋白定性等项目[80]，可作为感染初期诊断指标。

另外，还可通过直接比较CSF和血浆中生化指标比值的差异性进行鉴别[81-83]：TBM组CSF中氯化物、乳酸、CD64比值低于化脓性脑膜炎组，ADA、组蛋白高于化脓性脑膜炎组(P值均<0.01)，两组CSF与血浆糖比值差异无统计学意义(P>0.05)；TBM组血浆蛋白、组蛋白、氯化物、氮化物、乳酸均低于化脓性脑膜炎组，而ADA高于化脓性脑膜炎组(P<0.05)。

CSF细胞学是通过检测CSF中细胞数量、形态改变，以及各种细胞的百分比来进行研究。多数研究表明，化脓性脑膜炎CSF细胞学呈中性粒细胞增多反应，而TBM呈中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等混合细胞增多反应，具有诊断及鉴别诊断两病的重要意义[84-85]。

二、 TBM与CNM的鉴别诊断

CNM是新型隐球菌引起的脑膜非化脓性炎症，其临床表现、CSF检测和影像学方面与TBM极为相似[86-87]。由于我国结核病疫情较重，临床医师在诊断时会首先想到TBM而造成误诊，导致治疗不及时、预后差等问题；因此提高对CNM的认识，在未找到隐球菌前对疑似TBM而CSF不符合典型改变者，或疑似TBM但抗结核药物治疗无效者，尤其对与禽类有密切接触史者，以及长期应用抗生素、免疫抑制剂、糖皮质激素和HIV感染或AIDS患者应警惕并发CNM的可能[87]，采用多项指标检测有利于早期诊断[86-87]。

CSF涂片墨汁染色法是采用印度墨汁对离心沉淀后的CSF标本染色，通过镜下背景呈黑褐色而菌体不着色的现象检测CNM。目前，根据CSF涂片墨汁染色的病原学方法找到隐球菌或CSF检测隐球菌抗原阳性与TBM鉴别，可确诊CNM[88]。但CSF检测隐球菌抗原培养法周期长、敏感度低，难以早期诊断，影响患者预后。另外，结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)可通过检测MTB感染后特异性T细胞分泌的γ干扰素来快速判断近期是否感染结核，该方法2 d即可得出结果，在排除颅外结核感染后可作为鉴别TBM和CNM的辅助方法[89]，但由于检测费用相对较高而未在临床广泛应用。

三、 TBM与VM的鉴别诊断

由于TBM与VM的病程相似，CSF的某些临床检测结果相同，因此在临床上难以区分[90]，一旦误诊而应用糖皮质激素治疗后会引起MTB全身播散，后果极为严重。邹德智[91]的研究中对TBM和VM的CSF中乳酸水平进行监测发现，TBM 的CSF中乳酸均值(>3 mmol/L)高于VM均值(<2 mmol/L)，提示乳酸含量具备两者鉴别诊断的价值，尤其是初次检查结果还与疾病的严重程度有关。

CSF细胞学检查操作简便，所需时间短，对中枢神经系统疾病的鉴别诊断、病情和疗效评估有重要价值，值得大力推广应用。熊林和宋涛[92]通过探讨TBM与VM早期CSF细胞学情况，发现TBM嗜中性粒细胞所占比例明显高于VM。郑立恒等[93]的研究也证实了这一点，并表明多数VM的CSF白细胞中嗜中性粒细胞在1～3 d内迅速减少或消失，随后出现淋巴细胞学反应，随病情好转细胞数量恢复正常；TBM早期CSF白细胞以嗜中性粒细胞为主，随后呈混合细胞学反应，嗜中性粒细胞多在1个月后才有明显降低，随病情好转淋巴细胞升高直至正常。

四、多种脑膜炎间的鉴别诊断

结核感染时随着MTB越过血脑屏障侵入中枢神经系统，使得CSF呈现出淋巴细胞优势、蛋白质含量增加和低葡萄糖浓度的代谢改变过程。近年来，对于TBM与其他脑膜炎的鉴别诊断开始关注各疾病间代谢产物的变化。Dai等[94]通过全球代谢组学分析来鉴别TBM与VM、BM和CNM之间差异表达的代谢物，采用超高效液相色谱联用飞行四极杆时间质谱(UHPLC-QTOF-MS)来分析患者CSF中的代谢物，发现4种脑膜炎代谢特征的改变，其中TBM的代谢物和途径均有氨基酸、脂质和核酸的代谢参与，为TBM的诊断及鉴别诊断提供了有价值的信息。在未来的研究中，应注重验证研究结果和分析代谢产物的改变与疾病病理生理学之间的联系。

总 结

综上所述，TBM目前还没有一种高效、经济、便捷的诊断方法，最终确诊应结合患者具体临床表现、CSF检查和诊断性抗结核药物治疗的效果。CSF涂片镜检和培养法敏感度和特异度均较低，所需CSF标本量多，培养周期长，虽在近年来对两种检测方法进行改进，但效果仍不尽如人意，对早期诊断价值有限。PCR及相应分子水平技术检测CSF中 MTB的方法提高了敏感度与特异度，但所需仪器设备的高昂价格及对实验室和实验技术人员的高要求，使得在中低收入地区广泛应用受到限制。免疫检测方法较PCR等技术更为简单、易行，但对于TBM的诊断准确度仅处于中等水平，不能鉴别相似神经系统疾病，无法独立作为确诊TBM的方法。临床医师应加深对TBM临床表现的了解，掌握相似疾病间的鉴别诊断方法和及早进行诊断性抗结核药物治疗，将有助于快速诊断；实验室技术人员应重视各种检测方法的规范操作，以利于正确诊断；科研人员应注重CSF检查方法和检查项目的探索及MTB诊断方法的研究，在积极改进现有诊断技术的同时探索快速、高效、经济的新方法，并关注这种诊断方法的可及性；国家应加大对高效、准确诊断MTB方法的支持力度，积极引进先进技术并将其纳入医保，使快速诊断技术在临床得以广泛推广。